山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 張志焱 劉海濤 李金敏 李偉 張菊 谷巍

乳酸菌是動(dòng)物微生態(tài)制劑的主要菌種之一，其代謝產(chǎn)物中含有大量的乳酸、乙酸等有機(jī)酸以及抑菌素、維生素、消化酶、游離氨基酸等成分，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并且其中含有的乳酸菌素、過(guò)氧化氫和羅伊氏素等多種物質(zhì)具有抑菌活性，對(duì)動(dòng)物的腸道致病菌和腐敗菌有較強(qiáng)的拮抗作用（邱寶生等，2004）。目前對(duì)乳酸菌活菌制劑類產(chǎn)品作為動(dòng)物微生態(tài)產(chǎn)品添加劑使用的研究很多，但對(duì)其代謝產(chǎn)物的使用效果研究還鮮有報(bào)道，本研究就將植物乳桿菌的發(fā)酵離心上清液作為肉仔雞的開(kāi)口保健產(chǎn)品，探討植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞腸道菌群和血清抗氧化指標(biāo)的影響，為乳酸菌代謝產(chǎn)物的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備

1.1.1 供試菌株 植物乳桿菌LP99（Lactobacillus LP99），由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀5 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.5 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母膏5 g，土溫－801 g，蒸餾水 1000 mL，pH 6.0。

1.1.3 發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備 將植物乳桿菌LP 99菌種接種在MRS斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)復(fù)壯，24 h后傳代，再接種到裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的100 mL鹽水瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，接種到裝有1 LMRS液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，3500 g離心，取上清液即為植物乳桿菌LP 99的發(fā)酵代謝產(chǎn)物。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 選用1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞300只，分為空白對(duì)照組、抗生素組和發(fā)酵上清液組。其中發(fā)酵上清液組分為1、2 mL/d·只和3 mL/d·只三個(gè)劑量組，均采用1∶1稀釋方式飲水使用；抗生素選用氟苯尼考 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供），3 g兌20 kg水飲用。從2日齡開(kāi)始飲用，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)平行20只肉雞。采用雙層籠養(yǎng)，自由采食。試驗(yàn)周期為10 d。

1.3 日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平 采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，參照2004年我國(guó)肉仔雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T33-2004）進(jìn)行配制。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 腸道菌群 試驗(yàn)期間每3 d每組分別隨機(jī)抽取三只雞屠宰，屠宰雞均取直腸前端腸段放入液氮中，以備微生物測(cè)定。測(cè)定時(shí)在超凈工作臺(tái)中稱取直腸前端腸段內(nèi)容物1 g，加入到裝有100 mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，搖床振蕩30 min，10倍遞倍稀釋混勻平板法計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)大腸桿菌，沙門氏菌、乳酸桿菌的活菌數(shù)。

大腸桿菌用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，沙門氏菌用SS瓊脂培養(yǎng)基，乳酸桿菌用LBS培養(yǎng)基，大腸桿菌和沙門氏菌在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，乳酸桿菌在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。活菌數(shù)以每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)lg CFU/g表示。

1.4.2 血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)期間每5 d每組分別隨機(jī)抽取三只雞心臟采血，離心制備血清，-80℃凍存，用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

GSH-Px活性的測(cè)定采用二硫代二硝基苯甲酸法，SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥法。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后，采用SPSS16.0進(jìn)行方差分析，采用其中的Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響由表2可見(jiàn)，各乳酸菌代謝產(chǎn)物組和抗生素組的沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），抗生素組的乳酸菌活菌數(shù)顯著低于對(duì)照組和乳酸菌代謝產(chǎn)物組（P＜0.05），且乳酸菌代謝產(chǎn)物組的乳酸菌活菌數(shù)高于對(duì)照組，這說(shuō)明抗生素在殺滅沙門氏菌和大腸桿菌的同時(shí)，也殺死了大量的有益菌——乳酸菌，而乳酸菌代謝產(chǎn)物在抑制沙門氏菌和大腸桿菌的同時(shí)，還有利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。

表2 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞腸道微生物的影響lg CFU/g

2.2 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞血清抗氧化指標(biāo)的影響 由表3可見(jiàn)，飲用植物乳桿菌LP 99發(fā)酵代謝產(chǎn)物5 d和10 d后，各乳酸菌代謝產(chǎn)物組均能顯著地提高血清中GSH-Px的活性 （P＜0.05）。SOD活性各乳酸菌代謝產(chǎn)物組均高于對(duì)照組，但只有2 mL組與對(duì)照相比差異顯著 （P＜0.05），1 mL組和3 mL組與對(duì)照相比均差異不顯著（P＞0.05）?？股亟M（氟苯尼考組）雞只血清中的GSH-Px活性和SOD活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著提高。

表3 GSH-Px和SOD活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響大量研究證明，在雛雞日糧中添加乳酸菌制劑可顯著增加腸道益生菌的數(shù)量，有利于動(dòng)物腸道健康。李雪平等（2011）研究報(bào)道，日糧中添加乳酸菌制劑可顯著提高回腸中乳酸菌的含量，顯著降低回腸、盲腸中大腸桿菌的含量。王晶等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素組相比，添加同源乳酸菌能更好抑菌和低聚木糖可以使肉雞空腸的乳酸菌數(shù)提高20.21%（P ＜ 0.05）。許提森（2008）報(bào)道，投喂乳酸菌活菌制劑后，雞腸道中的雞傷寒沙門氏菌的數(shù)量明顯下降。但目前大量的研究均集中于乳酸菌活菌微生態(tài)制劑在肉雞日糧中的應(yīng)用效果研究，對(duì)其發(fā)酵代謝產(chǎn)物的應(yīng)用效果研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)利用植物乳桿菌LP99的液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物，采用飲用方式，飼喂肉仔雞結(jié)果表明，2～10日齡的肉仔雞飲用乳酸菌的代謝產(chǎn)物，在提高腸道乳酸菌數(shù)量的同時(shí)，可以顯著降低雞傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量。說(shuō)明乳酸菌的代謝產(chǎn)物可以很好地維持有益菌的優(yōu)勢(shì)作用，同時(shí)其中的有機(jī)酸、細(xì)菌素和過(guò)氧化氫等有效地抑制了沙門氏菌、大腸桿菌的繁殖，從而可以減少有毒代謝產(chǎn)物，減少腸道疾病的發(fā)生。試驗(yàn)同時(shí)證明，抗生素氟苯尼考在殺滅沙門氏菌和大腸桿菌的同時(shí)，也殺死了大量的有益菌——乳酸菌，從而破壞了健康雞只的腸道菌群平衡。

3.2 乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)肉仔雞血清抗氧化指標(biāo)的影響 體內(nèi)抗氧化酶主要包括GSH-Px、SOD等。GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化物分解的酶類，它可將H2O2還原為H2O，作用是清除體內(nèi)的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的毒性損傷。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，飲用植物乳桿菌LP99發(fā)酵代謝產(chǎn)物能顯著提高血清中的GSH-Px的活性（P＜0.05），從而明顯地提高機(jī)體的抗氧化機(jī)能，增強(qiáng)肉雞的免疫力。而抗生素氟苯尼考組的GSH-Px活性和SOD活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，肉仔雞飲用植物乳桿菌LP99的代謝產(chǎn)物可顯著降低腸道內(nèi)容物中沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量，并能一定程度上促進(jìn)腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌增殖，其中2 mL/d組可顯著提高肉仔雞血清中的GSH-Px活性和SOD活性（P＜0.05），提高機(jī)體的抗氧化能力，增強(qiáng)肉雞的免疫力。

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