劉麗英，陳 虹，李雪青

(中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津 300162)

近年來，真菌感染在免疫受損的病人群體中發(fā)病率迅速增加，其原因包括HIV感染、化療引起的中性粒細胞減少、器官移植引起的免疫抑制、廣譜抗生素的濫用以及激素的應用等。深部真菌感染已成為許多疾病的主要死亡原因之一［1］，而且真菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴重。因此，研究抗真菌藥物的作用機制，探究真菌耐藥機理受到越來越多的醫(yī)務工作者的重視。

影響真菌麥角甾醇生物合成和功能的藥物一直是抗真菌藥物研究的重點。臨床應用最成功且仍作為一線藥物而被廣泛應用的酮康唑、氟康唑、特比萘芬等，都是以麥角甾醇為作用靶點，發(fā)揮其抗真菌作用［2］。本實驗初步建立了采用高效液相色譜儀測定白色念珠菌中麥角甾醇含量的方法，以助于抗真菌藥物的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 PLAB(分子量432，乳白色粉末，難溶于水，純度＞95%，由武警醫(yī)學院生藥學教研室提供)，DMSO配制，高壓滅菌備用。

1.2 菌種 白色念珠菌C1a(中國醫(yī)學真菌保藏中心)。

1.3 試劑 麥角甾醇標準品［2］(Sigma公司，批號23408194);甲醇(天津市康科德科技有限公司)、石油醚(天津市科銳思精細化工有限公司)為分析純;酵母浸粉、胰蛋白胨、營養(yǎng)肉湯(北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司)。

1.4 溶液及培養(yǎng)基配制 皂化劑為新鮮配制的含15%NaOH的95%乙醇溶液;YEPD培養(yǎng)基為10%酵母浸粉、20%胰蛋白胨、20%葡萄糖，溶于三蒸水中，高壓滅菌后應用。

1.5 儀器 Millipore純水儀(Millipore公司);HZQX100A 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱;5000 μl、1000 μl加樣槍(法國GILSON);METTLER AE 260(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);SN－CS－2D單人凈化工作臺(蘇州凈化設備廠);低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);P 1000 Thermo electron Corporation高效液相色譜儀(熱電公司);N 2000色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所);CSF－1A超聲發(fā)生器(上海超聲波儀器廠);Phenomenex 色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);臥式矩形壓力蒸汽滅菌器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)。

1.6 方法

1.6.1 色譜分析條件 色譜柱:Phenomenex(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:100% 甲醇;流速:1.0 ml/min;檢測波長:210 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μl。

1.6.2 樣品的制備

1.6.2.1 標準品溶液 精確稱取麥角甾醇標準品0.0512 g，用流動相甲醇定容至20 ml，超聲振蕩溶解，并逐級倍比稀釋配制成 1.08、0.54、0.27、0.135、0.068和0.039 mg/ml等系列濃度作為標準貯備液。

1.6.2.2 樣品溶液 取白色念珠菌C1a接種于沙氏斜面，30℃培養(yǎng)2 d后接種于YEPD培養(yǎng)液中，30℃150 r/min振蕩培養(yǎng)28 h，活化兩次，使其處于對數(shù)生長期后期［3，4］。用 YEPD培養(yǎng)液調(diào)整真菌濃度至5×108cfu/ml。取此濃度菌液2 m1于250 m1錐形瓶中，加YEPD培養(yǎng)液98 ml，30℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)28 h。200 r/min離心10 min，PBS洗滌兩次至上清液無色，去上清液稱各菌濕質(zhì)量。精密稱取濕菌0.5 g，加PBS 2.5 m1和皂化劑6 m1，混勻，80℃水浴皂化60 min。加石油醚(沸程30～60℃)6 ml提取3次，將提取液合并，加水6 ml洗滌，醚層于60℃水浴揮干即得未皂化脂(NSLs)，加甲醇使溶液體積為0.5 m1/g濕菌，－20℃保存，HPLC法測定其麥角甾醇含量。

2 結(jié)果

2.1 麥角甾醇標準品峰位的確定 在已建立的色譜條件下，麥角甾醇保留時間為11.698 min，采用面積歸一化法按峰面積進行定量。標準品中麥角甾醇的色譜圖見圖1。

2.2 線性關系 將已經(jīng)配制好的各濃度標準品，在已建立的色譜條件下進樣20 μl，以進樣濃度(X)為橫坐標，相應的峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果麥角甾醇在0.068～1.08 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程為 Y=8×106X+29 172(r=0.9989，n=3)。

2.3 精密度試驗 以濃度為1.08 mg/ml的標準麥角甾醇為樣品，進樣20 μl，測定麥角甾醇的色譜峰峰面積，每4 h測一次，得日內(nèi)精密度;以濃度為 0.54 mg/ml的標準麥角甾醇為樣品，隔日測一次，得日間精密度，其RSD分別為4.58%和4.81%。

圖1 麥角甾醇標準品HPLC色譜圖

2.4 最低檢測限 樣品制備同標準曲線。當信噪比S/N＞3時，最低檢測濃度為0.0025 mg/ml。

2.5 穩(wěn)定性試驗 以提取的樣品溶液進行穩(wěn)定性試驗，連續(xù)進樣3次，測得的麥角甾醇RSD為5.2%。樣品中麥角甾醇的色譜圖如圖2。

圖2 樣品中麥角甾醇HPLC色譜圖

2.6 加樣回收試驗 精密稱取樣品9份，每份0.1 g，分別加入濃度為1.08 mg/ml的標準品25、50和100 μl，每個濃度配制3份樣品，混勻，作為供試品溶液，進樣20 μl，結(jié)果見表1。平均回收率為79.93%，RSD 為5.44%。

2.7 樣品測定 分別精密稱取三個批次制得濕菌0.5 g，按照樣品制備方法進行制備，注入高效液相色譜儀進行測定，測定結(jié)果見表2。結(jié)果白色念珠菌中麥角甾醇平均含量為(0.54 ±0.0720)μg/g。

表1 加樣回收率測定結(jié)果

表2 白色念珠菌中麥角甾醇含量

3 討論

真菌細胞膜為液態(tài)鑲嵌模型，在排列成雙層結(jié)構(gòu)的磷脂中夾雜有大量的麥角甾醇類化合物，另外合成甘露聚糖、β－葡聚糖、幾丁質(zhì)等細胞壁組分所必須的酶也位于細胞膜上。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要成分，在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜的流動性、膜結(jié)合酶的活性、細胞活力以及物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。麥角甾醇缺乏以及非平面甾醇前體累積會導致真菌膜的破裂［5］。因此臨床上很多抗真菌藥物主要通過抑制麥角甾醇的生物合成來達到抑菌效果［6］，如以兩性霉素B為代表的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌藥物可直接和細胞膜上的麥角甾醇結(jié)合，形成抗生素－甾醇復合物，破壞細胞膜的滲透性，以特比萘芬(terbinafine)為代表的烯丙胺類抗生素能抑制角鯊烯環(huán)氧化酶，引起角鯊烯在質(zhì)膜上累積，造成膜的損壞。以往國內(nèi)外學者多采用薄層掃描法、高效液相色譜法和氣相色譜法等來測定土壤、植物和藥品中麥角甾醇的含量［4，7－9］。薄層色譜雖然能夠分離，但結(jié)果不直觀，分離效果不理想，定量不準確;因甾醇類的沸點較高，直接用氣相色譜法分析則存在拖尾后峰型展寬等問題;通過硅烷化、衍生化進行測定，方法比較煩瑣。本實驗建立了以HPLC儀來定量測定真菌中麥角甾醇含量的方法，該方法簡便、快速、重復性好，為研究抗真菌藥物的作用機制提供了有效的手段。

1 Mitchell T G，Perfect J R.Cryptococcosis in the era of AIDS－100 years after the discovery of Cryptococcas neoformans［J］.Clin Microbial Rev，1995，8(4):515

2 Kaufmanns C A，Carver P L.Antifungal agents in the 1990s［J］.Drugs，1997，53(4):539

3 劉麗英，劉濤，畢文超，等.白色念珠菌的生長曲線和世代時間測定［J］.武警醫(yī)學院學報，2009，18(3):230

4 曹永兵，姜遠英，殷明，等.薄層色譜掃描法檢測氟康唑?qū)φ婢溄枪檀嫉挠绊懀跩］.第二軍醫(yī)大學學報，1999，20(4):312

5 Berg D，唐樹人.抗真菌的甾醇生物合成抑制劑［J］.國外醫(yī)藥·合成藥、生化藥、制劑分冊，1987，8(2):72

6 何秀萍，張博潤.微生物麥角甾醇的研究進展［J］.微生物學通報，1995，25(3):166

7 鄭力行，周曉瑜，施瑋.高效液相色譜法測定室內(nèi)屋塵麥角甾醇的含量［J］.復旦學報(醫(yī)學版)，2005，32(6):691

8 孫國明，賈海英.HPLC測定暖宮膠囊中麥角甾醇含量［J］.中國中藥雜志，2006，31(24):361

9 Thomas l，Jorgen A，Helle W R.Simplified and rapid method for extraction of ergosterol from natural samples and detection with quantitative and semiquantitative methods using thin － layer chromatography［J］.J Chromatogr A，2004，10(26):301