董淑英，鄭 超，蔣國(guó)君，韓 溪，童旭輝

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030）

縫隙連接(gap junction)是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交流的主要通道，由特殊的通道蛋白——連接蛋白(connexin)組成［1］?？p隙連接功能改變與腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。研究表明，與正常乳腺細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中縫隙連接功能有不同程度的降低或缺失，并且恢復(fù)或增強(qiáng)縫隙連接功能可能對(duì)化療藥物的抗腫瘤作用具有增效作用［2-3］。

Src激酶是由原癌基因src編碼的非受體型酪氨酸激酶。研究表明，Src在多種腫瘤細(xì)胞及組織中過表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等［4］。Src激酶可以降低細(xì)胞的縫隙連接功能［5］，而PP2作為Src激酶的特異性抑制劑，對(duì)乳腺癌細(xì)胞縫隙連接功能的影響尚不清楚。本課題組前期研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞株Hs578T中Cx43總蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞膜上Cx43的表達(dá)能較好反映藥物對(duì)乳腺癌縫隙連接功能的改變［3］，因此本實(shí)驗(yàn)通過Western blot及熒光示蹤法研究了Src激酶抑制劑PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞Src激酶表達(dá)及縫隙連接功能的影響，以期為提高化學(xué)藥物的抗腫瘤療效提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 Hs578T細(xì)胞系購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、PP2均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;高糖型DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品;熒光染料 Calcein-AM為 Molecular Probes公司產(chǎn)品。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hs578T細(xì)胞接種于含有10%(V/V)新生小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5% 二氧化碳以及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，1周傳代2～3 次，傳代比例為1∶2。

1.3 MTT法測(cè)定 Hs578T細(xì)胞的生長(zhǎng) 將Hs578T細(xì)胞接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為5000個(gè)/孔。每組藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，PP2終濃度為:1、2、4、8、16、32 μmol/L。加藥24 h(藥物作用終點(diǎn)時(shí)間)終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h，每孔加MTT 15μl(5 g/L)，棄上清液，加入二甲基亞砜 150μl/孔，微量振蕩器震搖10 min，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的570 nm波長(zhǎng)處吸光度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率按下述公式計(jì)算。

1.4 Western blot法檢測(cè)Src激酶表達(dá)水平將Hs578T細(xì)胞按每孔2 ml(細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L)接種于6孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞融合后，用不同濃度的PP2處理24 h和用 8 μmol/L PP2 處理 6 h、12 h、24 h。加藥后24 h，采用細(xì)胞全蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定所提取蛋白濃度。取蛋白150μg/組，12%SDS-PAGE凝膠電泳(80 V，30 min;120V，150 min);轉(zhuǎn)膜(50 V，180 min);5%脫脂牛奶室溫封閉過夜;一抗1∶4000稀釋，4℃孵育過夜;TPBS洗滌3次×10 min;二抗1∶4000稀釋，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次 ×10 min，PBS洗滌1次 ×15 min;ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。對(duì)Western blot結(jié)果中各條帶進(jìn)行灰度值掃描，取4次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，按正常對(duì)照組的Src激酶與其相應(yīng)的β-actin的比值進(jìn)行標(biāo)化計(jì)算(即設(shè)定正常對(duì)照組的Src激酶與其相應(yīng)的β-actin的比值為1)。

1.5 熒光示蹤法測(cè)定細(xì)胞間縫隙連接功能

將Hs578T細(xì)胞按每孔1 ml(細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L)接種于12孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞融合后，用不同濃度的PP2處理24 h 和用 8 μmol/L PP2 處理 6 h、12 h、24 h。加藥24 h后，將 Hs578T細(xì)胞與熒光指示劑calcein-AM共同孵育，使calcein-AM進(jìn)入細(xì)胞。該細(xì)胞稱為“供體細(xì)胞”。將“供體細(xì)胞”接種到已生長(zhǎng)融合的Hs578T細(xì)胞(“接受細(xì)胞”)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的縫隙連接后，小分子的calcein(發(fā)綠色熒光)可以通過縫隙連接進(jìn)入相鄰的“接受細(xì)胞”，用熒光顯微鏡觀察，記錄縫隙連接熒光傳遞功能。一個(gè)“供體細(xì)胞”周圍含有calcein的“接受細(xì)胞”數(shù)目作為縫隙連接功能的指標(biāo)［2］。取5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，按正常對(duì)照組的細(xì)胞熒光傳遞的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化(即設(shè)定正常對(duì)照組“供體細(xì)胞”周圍的“接受細(xì)胞”的數(shù)量為1)。

2 結(jié)果

2.1 PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響 先采用MTT法檢測(cè)0～32 μmol/L濃度下PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，在1～8 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，PP2作用 Hs578T細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為(98±3)% ～(94±4)%，與未用藥組(PP2為0 μmol/L)無明顯差異(P＞0.05)，表明其對(duì)細(xì)胞增殖幾無影響;而16、32 μmol/L PP2(超過 8 μmol/L 濃度范圍)作用Hs578T細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞存活率分別為(84±3)%和(75±4)%，與未用藥組(PP2為0 μmol/L)比較，細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.01)，表明該濃度范圍的PP2對(duì)細(xì)胞增殖有明抑制作用(圖1)。因此，實(shí)驗(yàn)中選取了對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響劑量范圍(1～8 μmol/L)的PP2，觀察其對(duì)細(xì)胞縫隙連接功能的影響。

圖1 不同濃度PP2對(duì)乳腺癌Hs578T細(xì)胞存活的影響(n=3)Fig.1 Effect of PP2 on survival of breast cancer cell Hs578T(n=3)

2.2 PP2增強(qiáng)Hs578T細(xì)胞縫隙連接功能 細(xì)胞熒光示蹤結(jié)果顯示，PP2(1～8 μmol/L)作用Hs578T細(xì)胞24 h可以增強(qiáng)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞功能(圖 2)。1、2、4、8 μmol/L PP2作用后細(xì)胞的標(biāo)化熒光傳遞強(qiáng)度分別為1.60 ±0.08、2.00 ±0.05、2.20 ±0.05、2.70 ±0.09，與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01);且高濃度PP2組與低濃度PP2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.01)。結(jié)果提示，1～8 μmol/L濃度范圍內(nèi)的PP2隨著用藥濃度增高，其對(duì)Hs578T細(xì)胞縫隙連接功能的增強(qiáng)作用更加明顯。

圖3顯示，8 μmol/L PP2預(yù)處理 Hs578T細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，可以增強(qiáng)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞功能。PP2預(yù)處理不同時(shí)間后細(xì)胞標(biāo)化熒光傳遞強(qiáng)度分別為1.4±0.05、1.7 ±0.06 及2.2 ±0.07，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且PP2長(zhǎng)時(shí)間作用與短時(shí)間作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果提示，6～24 h的時(shí)間范圍內(nèi)，長(zhǎng)作用時(shí)間8 μmol/L PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞的縫隙連接功能的作用更明顯。

2.3 PP2減少Hs578T細(xì)胞Src激酶的表達(dá)用1 ～ 8 μmol/L PP2處理Hs578T細(xì)胞24 h，可見 Src激酶表達(dá)均減少(圖 4)。1、2、4、8 μmol/L PP2作用后Hs578T細(xì)胞Src激酶表達(dá)與 β-actin 比值分別為 0.93 ±0.02、0.70 ±0.09、0.66 ±0.09、0.36 ±0.10，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.01);且高濃度PP2組與低濃度PP2組比較，其差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05～0.01)。

圖4 不同濃度PP2作用后乳腺癌細(xì)胞Hs578T Src激酶表達(dá) Western blot法檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Effect of PP2 with different concentrations on the expression of Src kinase of breast cancer cell Hs578T

進(jìn)一步觀察8 μmol/L PP2預(yù)處理Hs578T細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Src激酶表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，用8 μmol/L 預(yù)處理Hs578T 細(xì)胞6 h、12 h 和24 h，可以減少Src激酶表達(dá)(圖5)。8 μmol/L PP2作用細(xì)胞6、12、24 h后，其Src激酶表達(dá)與β-actin 比值分別為 0.82 ±0.03、0.66 ±0.08、0.59±0.09，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且PP2長(zhǎng)時(shí)間作用與短時(shí)間作用后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05～0.01)。

圖5 8 μmol/L PP2作用不同時(shí)間后乳腺癌細(xì)胞 Hs578TSrc激酶表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Effect of PP2 with 8 μmol/L on the expression of Src kinase in breast cancercells Hs578T fordifferent duration

3 討論

在腫瘤細(xì)胞中，縫隙連接功能增強(qiáng)對(duì)于抗腫瘤藥物具有一定的增效作用，而Src激酶對(duì)縫隙連接功能則有抑制作用。本研究探討了Src激酶的強(qiáng)選擇性抑制劑PP2［6-7］對(duì)乳腺癌細(xì)胞Hs578T的縫隙連接功能的影響及可能機(jī)制。對(duì)縫隙連接功能的研究常用的方法是劃痕法，但此法只可進(jìn)行定性研究，而熒光示蹤法則可對(duì)縫隙連接功能進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量研究［2］，所以本研究采用熒光示蹤法研究了 Src激酶抑制劑PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞中縫隙連接功能的影響，并采用Western blotting法檢測(cè)Src激酶的表達(dá)情況以探討其可能機(jī)制。為篩選出本身對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無明顯影響的PP2的濃度，為后續(xù)通過增強(qiáng)縫隙連接功能而增敏抗腫瘤藥的抗腫瘤作用研究提供依據(jù)，先觀察了PP2對(duì)乳腺癌Hs578T細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響。結(jié)果表明，PP2濃度在1～8 μmol/L時(shí)，對(duì)于乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)幾無影響。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)該濃度范圍的PP2可以顯著增強(qiáng)Hs578T細(xì)胞的縫隙連接功能，同時(shí)顯著降低Hs578T細(xì)胞中Src激酶的表達(dá)，因此可以推測(cè) PP2對(duì)Hs578T細(xì)胞的縫隙連接功能的增強(qiáng)作用可能與其降低Hs578T細(xì)胞中Src激酶的表達(dá)有關(guān)。

目前認(rèn)為Src激酶可以通過以下幾種途徑來影響細(xì)胞的縫隙連接功能:(1)影響作用于縫隙連接通道功能的蛋白質(zhì)的表達(dá);(2)作用于蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，進(jìn)而使連接蛋白磷酸化，抑制縫隙連接通道功能;(3)直接磷酸化連接蛋白連接蛋白43［7-8］。(4)Src通過下游的 Cas阻斷縫隙連接功能［8］。本研究Western blot結(jié)果提示，PP2可能通過直接抑制Src激酶的表達(dá)來間接調(diào)控Hs578T細(xì)胞之間的縫隙連接功能，但Src激酶調(diào)控縫隙連接功能的具體機(jī)制尚有待探討。

文獻(xiàn)報(bào)道，縫隙連接能顯著增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性［9］;此外，縫隙連接功能增強(qiáng)時(shí)也可促進(jìn)依托泊苷引起的成膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［10］。Kashiwagi［11］報(bào)道，Src 激酶抑制劑 Su6656 可以顯著增強(qiáng)順鉑在H28細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。PP2是一種強(qiáng)選擇性的Src激酶抑制劑，本研究結(jié)果表明:PP2在乳腺癌細(xì)胞中可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的縫隙連接功能。因此我們推測(cè)，作為Src激酶的特異性抑制劑PP2可能會(huì)通過增強(qiáng)縫隙連接功能而增強(qiáng)化學(xué)藥物的抗乳腺癌作用，該研究將為乳腺癌的治療提供一個(gè)新的思路。

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