江蘇省泰州市食品藥品檢驗所（225300）黃勇 柏大為

根據(jù)2010年版《中國藥典（二部）》的規(guī)定[1]，建立藥品無菌檢查方法時。應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗證，以證明方法的適用性。注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、傷寒沙門菌、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬等腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單孢菌有良好抗菌作用。頭孢哌酮主要抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。舒巴坦本身抑菌作用較弱，是一種競爭性、不可逆的β內(nèi)酰胺酶抑制藥，與頭孢哌酮聯(lián)合應(yīng)用后，可增加頭孢哌酮抵抗多種β內(nèi)酰胺酶降解的能力，對頭孢哌酮產(chǎn)生明顯的增效作用[2][3][4]。為確保方法科學(xué)、結(jié)果準(zhǔn)確，本文建立了注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉無菌檢查方法，并驗證檢查法的可靠性，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HTY-2000A集菌儀、脫卸式薄膜過濾器，均由杭州高德醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PL202-L電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 菌種 驗證用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]第4代；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]第3代；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]第4代；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]第4代；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]第3代；銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（F）10104]第3代。

1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基為硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均為符合藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 稀釋劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液均按藥典方法配制。

1.5 樣品 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（齊魯制藥有限公司，批號為1070229BR，規(guī)格1.0g/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1ml，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)物1ml，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)5～7d，用0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗脫并過濾孢子懸液至無菌試管內(nèi)，再取孢子懸液1ml加0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液5ml，作為原液，備用。取原液1ml，加0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成含50～100cfu的孢子懸液。

2.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3d；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種細(xì)菌作為空白對照，培養(yǎng)5d，每日觀察結(jié)果。結(jié)果如下：空白對照管無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管細(xì)菌均生長良好，結(jié)果靈敏度檢查符合規(guī)定。見附表1。

2.3 方法驗證

2.3.1 方法的選擇 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉為注射用凍干粉針，抗生素有較強(qiáng)的抑菌作用，所以采用薄膜過濾法進(jìn)行試驗。

2.3.2 方法驗證試驗1 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，作為供試品溶液，采用封閉式薄膜過濾器過濾，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為供試品陰性對照組，另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量實驗菌，作為供試品陽性菌試驗組，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。陰性對照組：用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗100ml，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml。結(jié)果見附表2和3。

附表1 培養(yǎng)及靈敏度檢查結(jié)果

附表2 試品陽性菌試驗組實驗結(jié)果觀察表

附表3 供試品陰性與陰性對照組實驗結(jié)果觀察

2.3.3 方法驗證試驗2 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，作為供試品溶液，采用封閉式薄膜過濾器過濾，用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入青霉素酶（1ml/筒）并放置5min后濾干，沖洗完畢后，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為供試品陰性對照組，另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量實驗菌，作為供試品陽性菌試驗組，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。陰性對照組：用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，沖洗完畢后向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml。結(jié)果見附表2和3。

2.3.4 培養(yǎng)條件及結(jié)果觀察 由附表2和3可見，在驗證試驗1的條件下，對細(xì)菌，特別是銅綠假單孢菌和大腸埃希菌有明顯抑制作用，而實驗條件2中含供試品各管的實驗菌試驗組在300ml/膜沖洗并加入加入青霉素酶（1ml/筒）時各濾筒微生物均生長良好，陰性對照及樣品澄清無菌生長，試驗組有菌生長。說明在該檢驗條件下已去除注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的抑菌作用。

2.4 樣品的無菌檢查 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用封閉式薄膜過濾器過濾，用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗（400ml/筒），每次100ml，在最后一次沖洗液中加入青霉素酶（1ml/筒）并放置5min后濾干，于兩筒中接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（其中一筒加入小于100cfu的金黃色葡萄球菌作為陽性對照管），另一筒加入改良馬丁培養(yǎng)基，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14d，逐日觀察生長情況。

本實驗結(jié)果顯示，供試品無菌檢查陽性對照菌筒均在24h內(nèi)正常生長，陰性對照均澄清呈無菌生長，無菌試驗結(jié)果符合規(guī)定，證明所建立的無菌檢查法科學(xué)、可靠，該實驗條件能消除頭孢匹胺鈉對細(xì)菌的抑制作用。

3 討論

3.1 通過方法驗證試驗表明注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉在未沖洗時對細(xì)菌有明顯的抑制作用，在沖洗量達(dá)到1000ml并加入青霉素酶之后抑菌作用消除，可以達(dá)到驗證試驗要求。

3.2 薄膜過濾法操作過程中應(yīng)注意：在每次加沖洗液前應(yīng)盡量抽干，每次加沖洗液后要充分振搖，每次沖洗量控制在50ml，其沖洗總量會顯著降低。