張娟 崔天祥 李莉

心肌梗死后大鼠periostin蛋白表達(dá)量與瑞舒伐他汀干預(yù)作用研究

張娟 崔天祥 李莉

目的觀察心肌梗死后大鼠periostin(Pn)表達(dá)與瑞舒伐他汀的作用關(guān)系，探討瑞舒伐他汀在梗死后心肌重構(gòu)中的作用機(jī)制。方法雌性54只遠(yuǎn)交群(SD)大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、瑞舒伐他汀組,每組18只。其中36只(SD)大鼠，結(jié)扎左前降支建立急性心肌梗死模型，隨機(jī)分為急性心肌梗死(AMI)對(duì)照組和瑞舒伐他汀(ROS)干預(yù)組；另18只為假手術(shù)組(Sham)，只穿線不結(jié)扎。ROS組大鼠以6 mgROS/(kg·d)灌胃，另兩組以等量清水灌胃。4周后測(cè)定各組大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、periostin蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表達(dá)量。結(jié)果與AMⅠ組相比，ROS組心肌CVF、periostin 蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，ROS組和AMⅠ組相關(guān)指標(biāo)均顯著高于Sham組(P<0.05)。結(jié)論瑞舒伐他汀能夠顯著降低受損心肌中periostin表達(dá)水平，可能是其改善心肌重塑的機(jī)制之一。

瑞舒伐他汀；心肌梗死；Periostin；大鼠

心肌梗死后心室重塑是個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，是心力衰竭持續(xù)發(fā)展進(jìn)程中極其重要的環(huán)節(jié)。在多種參與心室重塑的因素如神經(jīng)體液因素、炎癥因子等的作用下，主要來源于心臟成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MyoFBs)在以膠原沉積和間質(zhì)纖維化為主要特征的基質(zhì)重塑中，發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)與肌成纖維細(xì)胞交互作用，對(duì)膠原代謝和間質(zhì)纖維化起到重要的調(diào)控作用。因此，心肌梗死后肌成纖維細(xì)胞已經(jīng)成為控制纖維化進(jìn)展的重要靶細(xì)胞。對(duì)肌成纖維細(xì)胞的增殖及分化進(jìn)行干預(yù)是治療心肌間質(zhì)纖維化、防止心室重塑的可行途徑。

鑒于periostin的病理性促纖維化與血管新生作用，越來越多的研究者已經(jīng)開始關(guān)注它在心血管疾病中的特殊功能。如何有效干預(yù)由其介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，對(duì)逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重塑具有重要意義。本研究擬在利用瑞舒伐他汀調(diào)脂以外的作用，觀察其對(duì)急性心肌梗死后periostin的干預(yù)效果，探討其改善心肌重塑的機(jī)制，為利用瑞舒伐他汀改善急性心肌梗死后心肌重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 瑞舒伐他汀片(阿斯利康制藥有限公司)；SP9000試劑盒(北京中杉生物工程公司)；DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；RT-PCR 試劑盒(Transgene公司)；引物由北京博大泰克公司合成。periostin兔多克隆抗體(上海薩博生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及分組 選取8周齡SD雌性大鼠，體重255～306 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分3組每組各18只大鼠，假手術(shù)組：只在左前降支相應(yīng)部位穿線。急性心肌梗死模型組：按文獻(xiàn)[1]的方法結(jié)扎左前降支建立。術(shù)后給予青霉素40萬U/(kg·d)預(yù)防感染，共3 d。術(shù)后24 h將急性心肌梗死大鼠隨即分為AMI對(duì)照組和ROS 干預(yù)組。ROS組每只老鼠以6 mgROS/(kg·d)溶于1 ml清水中灌胃，AMⅠ組和Sham組以1 ml清水灌胃。實(shí)驗(yàn)大鼠均自由飲食。4周后頸椎脫臼法處死動(dòng)物，摘取心臟，在梗死區(qū)沿左心室長(zhǎng)軸一分為二，取梗死交界區(qū)組織，一部分10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片，行病理鏡檢；一部分液氮保存，留做RT-PCR行periostin蛋白表達(dá)測(cè)定。

1.2.2Masson染色測(cè)定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF) 切片脫蠟，Masson染色法將膠原纖維染成綠色，心肌染為紅色，在光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)觀察，使用圖像分析軟件(Biosens Digital Imaging System v1.6)分析，CVF的計(jì)算方法為：膠原面積/總面積。

1.2.3免疫組化檢測(cè)心梗交界區(qū)periostin的表達(dá)(SP法)免疫組化染色梗死交界區(qū)心肌組織，最后經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后，陽染產(chǎn)物胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色。各組圖片應(yīng)用分析軟件(Biosens Digital Imaging System v1.6)進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)取5點(diǎn)測(cè)量，取平均值。陽性產(chǎn)物強(qiáng)度用圖像處理系統(tǒng)灰度值表示。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)心梗交界區(qū)periostin mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑處理梗死交界區(qū)心肌組織(約110 mg)提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將8 μL總RNA合成cDNA。擴(kuò)增Periostin序列上游引物：5’ ACTCCGTGTCTTCGTGTATC 3’，下游引物：5’ CTTTCTTCATTAGTCATTCCCT 3’，擴(kuò)增片段為279bp；擴(kuò)增TGF-β1序列上游引物：5’ CCCACTGATACGCCTGAG 3’，下游引物：5’ GGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3’，擴(kuò)增片段為469bp；內(nèi)參GAPDH序列上游引物：5’ AAGTTCAACGGCACAGTCAA 3’，下游引物：5’ TCCACGACATACTCAGCACC 3’，擴(kuò)增片段為128bp。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別應(yīng)用各組上下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，退火30 s (periostin為52 ℃，TGF-β1為54 ℃，GAPDH為 55 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃總延伸 5 min。取 5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察電泳條帶，D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，檢測(cè)因子mRNA的表達(dá)量及DNA條帶和GAPDH 的DNA條帶灰度值比值計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1各組CVF及periostin蛋白表達(dá)量的比較 Masson染色顯示：Sham組有極少量膠原纖維形成，AMⅠ組大量膠原纖維形成，ROS組介于兩者之間；免疫組化染色結(jié)果顯示：AMⅠ組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)中periostin表達(dá)量最多，ROS組相對(duì)減少；AMⅠ組及ROS組CVF、periostin蛋白均顯著高于Sham組(P<0.05)，ROS組CVF、periostin蛋白與AMⅠ組相比均顯著降低(P<0.05)，見圖1及表1。

圖1 各組大鼠心肌組織的免疫組化染色(SP染色法，×400)

注：A:Sham組；B: AMⅠ組；C: ROS組

2.2各組periostin mRNA表達(dá)的比較 AMⅠ組和ROS組與Sham組相比較，TGF-β1及periostin mRNA的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；ROS組與AMⅠ組相比，TGF-β1及periostin mRNA的表達(dá)均顯著減少(P<0.05)，見圖2及表2。

圖2 各組大鼠心肌組織periostin mRNA的表達(dá)(RT-PCR)

注：A:periostin mRNA的表達(dá)；B:TGF-β1 mRNA的表達(dá)。

M:DAN maker；1：假手術(shù)組；2：AMⅠ組；3：ROS組

表1 瑞舒伐他汀對(duì)CVF、periostin蛋白的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與心肌梗死組比較，△P<0.05

表2 瑞舒伐他汀對(duì)periostin、TGF-β1 mRNA的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與AMⅠ組比較，△P<0.05

3 討論

在心肌梗死發(fā)生直至壞死心肌被纖維組織替代這一過程中，肌成纖維細(xì)胞是梗死區(qū)域中主要的細(xì)胞類型，肌成纖維細(xì)胞通過增強(qiáng)的遷移、增殖及分泌活性增加膠原的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)間的交聯(lián)，在促進(jìn)損傷部位愈合和瘢痕組織形成的同時(shí)，引起膠原的過度沉積，纖維化的增加使心室的順應(yīng)性下降，重塑明顯，導(dǎo)致心肌僵硬度增加和舒縮功能障礙,最終心力衰竭必然會(huì)出現(xiàn)。心肌梗死后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活，Ang-Ⅱ可以刺激成纖維細(xì)胞等分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)，引起膠原合成增多。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1誘導(dǎo)膠原分泌增加，使大鼠心臟成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增高。

Periostin是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要由成纖維細(xì)胞分泌，通過抑制心肌細(xì)胞擴(kuò)散及成纖維細(xì)胞的黏附造成心肌肌束滑動(dòng)進(jìn)而導(dǎo)致心腔擴(kuò)大和心功能受損[2]。損傷、壓力負(fù)荷、應(yīng)激、炎癥等均可引起Periostin蛋白表達(dá)上調(diào)。periostin蛋白可與膠原-I、膠原-V、 粘連蛋白等基質(zhì)蛋白結(jié)合參與生理性及病理性纖維化的形成[3]。Iekushi等[4]在急性心肌梗死大鼠中使用纈沙坦治療后發(fā)現(xiàn)，纈沙坦可通過抑制 periostin表達(dá)來改善心功能及心肌梗死后心室重塑。

許多研究表明，他汀類藥物除降脂外，還有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗增殖抗氧化應(yīng)激、抗血檢形成、抑制新生血管形成等多重作用，目前被認(rèn)為是治療冠心病及預(yù)防冠脈成形術(shù)后再狹窄的理想藥物。但他汀類藥物抑制VSMC增殖、遷移及血管再狹窄的機(jī)制仍未完全明了，他汀類藥物是否能通過抑制Pn表達(dá)而進(jìn)一步抑制心室肌重構(gòu)尚未見報(bào)道。然而他汀類藥物對(duì)AMI后心室重構(gòu)的影響是否也與periostin表達(dá)有關(guān)，目前仍未見報(bào)道。

本研究以檢測(cè)心肌periostin的變化來反映瑞舒伐他汀的抗心肌重構(gòu)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與AMⅠ組相比，ROS組心肌periostin、TGF-β1表達(dá)明顯降低，膠原容積分?jǐn)?shù)降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)瑞舒伐他汀能夠降低梗死交界區(qū)心肌periostin的表達(dá)，可改善急性心肌梗死后心肌重塑，其機(jī)制可能為瑞舒伐他汀通過降低TGF-β1的水平，調(diào)節(jié)periostin的表達(dá)，從而減少膠原的沉積，這為治療急性心肌梗死后心室重構(gòu)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但深入的其他機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

[1] 王勇, 高大中, 殷躍輝, 等.大鼠心肌梗死模型建立方法選擇及心電圖表現(xiàn).中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2011,19(6):525-529.

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Effectsofrosuvastatinonexpressionofperiostinproteininratswithacutemyocardialinfarction.

ZHANGJuan,CUITian-xiang，LILi.

CardiovascularDepartment,TheSecondaffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou, 450014,China.

ObjectiveTo evaluate the effects of rosuvastatin on expression of periostin (Pn)protein in rats with acute myocardial infarction and to investigate the improvement of myocardial reconstruction mechanism.MethodsFemale adult SD rats were randomly divided into sham group, model group and benazepril group (18in each group). Thirty-six female SD rats with ligated LAD were used to establish models of acute myocardial infarction (AMI), twenty four hours later, the models were randomly divided into acute myocardial infarction (AMI) as control group and rosuvastatin intervention (ROS) group.Another 18 rats were tested with pierced but not ligated LAD as sham-operated group (Sham). Rats in ROS group were given rosuvastatin by gavage at 6 mg/(kg·d) dose levels to soluble in 1 ml clear water, whereas rats in the other two groups were given 1 ml clear water each day. Four weeks later, compare the differences of collagen volume fraction (CVF), periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA.ResultsMyocardial CVF, periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA were reduced in the ROS group compared with rats in the AMI group (P<0.05), both ROS group and AMI group were significantly higher than those in the Sham group (P<0.05).ConclusionRosuvastatin can reduce the expression of periostin in the damaged myocardial, may be one of the mechanism of myocardial remodeling improvement.

Rosuvastatin; Myocardiac infarction; Periostin; Rat

450014 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科

張娟 E-mail：doczj@hotmail.com