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(余姚市禽畜病防治研究所，浙江余姚 315400)

自2012年7月以來,浙江和江蘇境內(nèi)部分種鵝場的種鵝發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率下降，并有少量死亡的疾病，使部分種鵝場遭受了巨大經(jīng)濟損失。病鵝主要表現(xiàn)為食欲減退，排黃綠色糞便，部分病鵝出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭頸扭曲，發(fā)病10 d后，產(chǎn)蛋率下降70%～80%，采用多種抗生素治療，無明顯效果。

為探明近期引起浙江和江蘇部分地區(qū)種鵝產(chǎn)蛋性能下降并引起死亡的病因，為制定鵝病防治措施提供依據(jù)。筆者對浙江和江蘇境內(nèi)三家發(fā)病典型的種鵝場進行系統(tǒng)病原研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1細菌分離 病料采自浙江和江蘇境內(nèi)三家種鵝場的病死鵝。無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱和血平板上，37℃培養(yǎng)24 h。另外，用肝臟直接涂片，進行瑞氏染色和革蘭氏染色。

1.2RT-PCR檢測 采集病死鵝肝臟、脾臟及出血、壞死的卵泡膜，常規(guī)法勻漿，反復凍融3次，用RNAsimple Total RNA Kit提取RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作按說明書進行。按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準的禽流感RT-PCR檢測方法進行禽流感檢測[1]；按照Liu(2007)[2]建立的新城疫病毒檢測方法進行新城疫病毒檢測；鴨坦布蘇病毒檢測采用本實驗室建立的鴨坦布蘇病毒RT-PCR檢測方法檢測：RT-PCR方法擴增的目的片段為420 bp，PCR反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master Mix(購自TIANGEN)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL)，模板2 μL，用水補充體積至25 μL；反應程序為：94℃預變性4 min，按94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s進行35個循環(huán)，然后72℃延伸7 min結(jié)束反應，取5 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察PCR擴增結(jié)果。

1.3病毒分離 無菌采集3家種鵝場(分別標記為場1、場2、場3)的病死鵝脾臟，出血、壞死卵泡膜，按常規(guī)方法勻漿，反復凍融3次后，離心15 min(8000 rmp/min)，取上清液用直徑為0.22 μm的一次性無菌濾器過濾后，各接種9日齡SPF雞胚5枚，去除24 h內(nèi)死胚，觀察雞胚死亡情況。收集24 h后死胚及5 d內(nèi)未死活胚尿囊液，按常規(guī)方法進行血凝試驗[3]，并按照1.2方法進行鴨坦布蘇病毒檢測。

2 試驗結(jié)果

2.1病變觀察 主要病變?yōu)槠⑴K腫大，有大量白色壞死點；卵泡膜充血、出血，卵泡液化、壞死，有的卵泡破裂(詳見圖1)；部分病鵝肝臟腫大，其他臟器無明顯病變。

2.2細菌分離 病死鵝肝臟直接涂片染色鏡檢，在1000倍油鏡下未觀察到細菌，劃線接種的麥康凱平板和血平板于37℃培養(yǎng)24 h后均無細菌生長。

2.3RT-PCR檢測 病料組織RNA，分別進行禽流感、新城疫和鴨坦布蘇病毒檢測，結(jié)果3份病料只有采用鴨坦布蘇病毒檢測引物PCR擴增獲得特異性片段，且大小與目的片段一致(詳見圖2)。

圖1 剖檢病變

M：1500 bp DNA Marker；1：陽性對照；2,3,4：檢測樣品；5：陰性對照

2.4病毒分離 病料接種SPF雞胚后4 h，場1、場2均有4枚雞胚死亡，死胚尿囊液中有大量尿酸鹽，肝臟、腎臟出血腫大。收集死胚和活胚尿囊液常規(guī)血凝試驗。結(jié)果所有尿囊液均不能凝聚1%雞紅細胞。對尿囊液進行鴨坦布蘇病毒RT-PCR檢測，只有死胚尿囊液能擴增出特異性目的片段，表明分離到的兩株病毒為鵝源鴨坦布蘇病毒。

通過對3家種鵝場送檢的病死鵝進行剖檢病變觀察，病料細菌分離、RT-PCR檢測及病毒分離，結(jié)果表明鴨坦布蘇病毒感染是導致種鵝產(chǎn)蛋率下降的主要病因。

3 小結(jié)與討論

鴨坦布蘇病毒是2010年4月出現(xiàn)的一種新病毒，陸新浩等(2012)[4]首次報道浙江地區(qū)的蛋鴨發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率大幅下降為主要特征的新疫病，但未對該病原進行鑒定。隨后曹貞貞等[5-8]通過病毒分離、RT-PCR擴增和基因序列分析等系統(tǒng)研究證實該病的病原為鴨坦布蘇病毒，屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的一種新病毒，病毒粒子呈球形，直徑為30～50 nm的有囊膜單股正鏈RNA病毒。目前對鴨坦布蘇病毒病的確診主要依靠病毒分離和分子生物學檢測[9]。

目前，鵝感染鴨坦布蘇病毒的資料報道較少，據(jù)黃欣梅(2011)[10]報道，2010年4月至11月在江蘇地區(qū)的鵝群曾發(fā)生鴨坦布蘇病毒感染，造成種鵝產(chǎn)蛋率大幅下降、肉鵝大批死亡，部分病鵝出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，主要病變?yōu)槁殉病⒛X膜、肝臟等多器官出血，脾臟腫大壞死。臨床癥狀和剖檢病變與本研究病例癥狀基本一致。另外，為了確診引起近期浙江及江蘇部分地區(qū)種鵝產(chǎn)蛋率下降病因，筆者曾對病死鵝進行了RT-PCR檢測和病毒分離，證實該病的病原是鴨坦布蘇病毒。有關(guān)鴨坦布蘇病毒的流行規(guī)律、病原特性、防治措施等有待進一步研究探討。

[1] 國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準“禽流感病毒RT-PCR試驗方法”[S].NYT 772-2004.

[2] Liu H, WangZ, Wu Y, etal. Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005 [J]. J Virol Methods,2007,140:206-211.

[3] 殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997:262-264,351-354,632.

[4] 陸新浩，陳秋英，劉鴻，等. 當前產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋驟然下降的病因初探[J].中國家禽，2010,32(23)：49-50.

[5] 曹貞貞,張存,黃瑜,等.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(12):3-6.

[6] 萬春和,施少華, 程龍飛, 等. 一種引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學報,2010,25(6):663-666.

[7] Su J, Li S, Hu X, et al. Duck Egg-Drop Syndrome Caused by BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus [J]. PlosONE, 2011,6(3):e18106.doi:10.1371/journal.pone.0018106.

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[9] 朱麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進展[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，20(1):79-82.

[10] 黃欣梅，李銀，趙冬敏等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27(2)：354-360.