桑艷梅 張亞楠 劉敏 閆潔

·短篇論著·

先天性高胰島素血癥四例ABCC8基因突變分析

桑艷梅 張亞楠 劉敏 閆潔

先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism, CHI)是嬰兒持續(xù)性、復(fù)發(fā)性低血糖的主要原因之一，迄今已發(fā)現(xiàn)了8種遺傳學(xué)類型。ATP敏感性鉀通道型先天性高胰島素血癥(KATP-CHI)是CHI最嚴(yán)重和最常見(jiàn)的類型，約占CHI患兒的40%～45%，其中82%的患兒對(duì)二氮嗪治療無(wú)效[1-2]。ATP 結(jié)合暗盒蛋白家族C8(ATP-binding cassette subfamily C 8, ABCC8)基因編碼的磺脲受體1(SUR1)是CHI最主要的致病基因，迄今已發(fā)現(xiàn)了150多種突變[3]。其遺傳方式多為常染色體隱性遺傳，少數(shù)為常染色體顯性遺傳，偶見(jiàn)新生突變。國(guó)外研究資料顯示不同類型的ABCC8基因突變臨床表現(xiàn)有著較大的異質(zhì)性。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)4例CHI患兒家系的ABCC8基因的39個(gè)外顯子區(qū)進(jìn)行測(cè)序，以期揭示CHI的致病機(jī)制。

一、材料與方法

1．一般資料：4例臨床診斷為CHI患兒的一般情況見(jiàn)表1。2例患兒為足月適于胎齡兒，2例患兒為巨大兒。4例患兒母親在孕期均體健，均無(wú)糖耐量異常病史，均無(wú)低血糖及糖尿病家族史。胰腺影像學(xué)檢查均未見(jiàn)異常。

表1 4例CHI患兒臨床資料及二氮嗪治療的療效

2．治療經(jīng)過(guò)：3例患兒確診后曾予以二氮嗪為期7～10 d的試驗(yàn)性治療，當(dāng)二氮嗪增加至15 mg·kg-1·d-1時(shí)3例患兒仍表現(xiàn)頻繁發(fā)作的低血糖，提示該3例患兒對(duì)二氮嗪治療無(wú)效，故予以停用。其中病例1經(jīng)知情同意后轉(zhuǎn)入外科進(jìn)行了胰腺次全切除術(shù)治療，術(shù)后血糖恢復(fù)至正常水平，經(jīng)長(zhǎng)期隨訪，胰腺內(nèi)、外分泌功能正常。病例2和3繼續(xù)予以多餐喂養(yǎng)、喂食葡萄糖等內(nèi)科非手術(shù)治療。病例4應(yīng)用奧曲肽治療1個(gè)多月，患兒血糖控制良好，但因奧曲肽價(jià)格昂貴，予以停用，改用多餐喂養(yǎng)及喂食葡萄糖等內(nèi)科治療。

3．遺傳學(xué)分析：分別留取4例CHI患兒家系的外周血，用promega公司基因組提取試劑盒提取基因組DNA。利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ABCC8基因39個(gè)外顯子區(qū)的相應(yīng)引物。PCR反應(yīng)體積： 5×GoTaq緩沖液10 μl，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各1 μmol/L，1.25 U熱啟動(dòng)Taq酶(Promega公司)，總體積50 μl。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s、62～64℃(ABCC8及KCNJ11基因)或58～62℃(GLUD1基因)30 s、72℃ 45 s，循環(huán)38次，最后72℃延長(zhǎng)5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收(Tiangen公司凝膠回收試劑盒)，純化，送北京英俊公司(Invitrogen)測(cè)序。本項(xiàng)研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并于抽血前獲得患兒父母的知情同意。

二、結(jié)果

病例3患兒及其母親ABCC8基因的第29外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)c.3650 G>A雜合突變，患兒父親該位點(diǎn)基因型正常(G/G)，該突變的遺傳方式為母系常染色體顯性遺傳。該突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第1217位氨基酸性質(zhì)由精氨酸(R)變?yōu)橘嚢彼?K，圖1)。該突變既往文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。

圖1 病例3 ABCC8基因測(cè)序圖

病例4患兒及其父親ABCC8基因的第37外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)c.4487 G>A雜合突變，患兒母親該位點(diǎn)的基因型正常，該突變的遺傳方式為父系遺傳。該突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第1493位氨基酸殘基由精氨酸(R)突變?yōu)楣劝滨?Q，圖2)。該突變?cè)形墨I(xiàn)報(bào)道。

圖2 病例4 ABCC8測(cè)序圖

討論ABCC8基因突變是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與CHI有關(guān)的基因，也是CHI最常見(jiàn)的致病基因。ABCC8基因由39個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度超過(guò)100 kb，編碼1582個(gè)氨基酸，核酸重約177 000。位于染色體11p15.1。

本研究4例CHI患兒中1例為ABCC8基因第29外顯子區(qū)G>A雜合突變，為母系常染色體顯性遺傳，既往文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道,提示其為罕見(jiàn)的ABCC8突變類型。常染色體顯性遺傳基因突變所致的KATP-CHI臨床上相對(duì)少見(jiàn)，其遺傳方式包括父系遺傳及母系遺傳[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，由母系遺傳的ABCC8突變所致的CHI患兒臨床癥狀較輕，由于二氮嗪可結(jié)合正常的SUR1亞單位形成雜聚鈦復(fù)合體或有足夠的正常鉀離子通道，所以該類患兒多對(duì)藥物治療有效，經(jīng)不同時(shí)間的治療后患兒的低血糖癥狀多可緩解或消失，從而避免了胰腺切除術(shù)所引起的一系列不良反應(yīng)及并發(fā)癥的發(fā)生[5]。

本研究中1例為ABCC8基因第37外顯子區(qū)G>A雜合突變，為父系常染色體顯性遺傳，既往文獻(xiàn)已有報(bào)道。國(guó)外研究資料顯示：父系遺傳的ABCC8基因突變包括了下列兩種可能性：(1)父系遺傳的常染色體顯性遺傳基因突變，即父親和患兒均攜帶同樣的突變，患兒母親突變位點(diǎn)的基因型正常。該類突變CHI的組織學(xué)類型為彌散型?；純号R床癥狀輕重不一，起病年齡偏早，且多對(duì)二氮嗪等藥物治療無(wú)效，需行不同程度的胰腺切除術(shù)來(lái)控制低血糖的發(fā)生[6]。(2)常染色體隱性遺傳基因突變的特殊類型，即體細(xì)胞父系A(chǔ)BCC8突變伴胰腺病灶內(nèi)母系染色體片段(11p15)缺失，該丟失的染色體區(qū)域內(nèi)含有β細(xì)胞鉀通道ABCC8和KCNJ11基因和印記的腫瘤抑制基因。這種特殊的基因組合造成受影響的β細(xì)胞中突變基因半合子數(shù)目減少和細(xì)胞生長(zhǎng)的不平衡，最終導(dǎo)致局灶型KATP-CHI[7]。該型患兒多存在鉀通道構(gòu)成的異常，病情較重，多于新生兒期發(fā)病，出生體重多為巨大兒，患兒于出生后幾天內(nèi)即表現(xiàn)出嚴(yán)重而持續(xù)性的低血糖癥，需要大量的葡萄糖維持血糖的正常，還常伴有低血糖引起的抽搐、驚厥、肌張力低下、喂養(yǎng)困難、呼吸暫停等；多對(duì)二氮嗪等藥物治療無(wú)效、需行不同程度的胰腺切除術(shù)來(lái)控制低血糖的發(fā)生[8]。本研究中1例于生后4個(gè)月起病，出生體重正常，對(duì)二氮嗪治療無(wú)效，提示其為常染色體顯性遺傳基因突變所致的KATP-CHI可能性大。按照國(guó)外經(jīng)驗(yàn)，對(duì)此類患兒應(yīng)進(jìn)一步行18F-L-Dopa PET SCAN 等影像學(xué)檢查協(xié)助組織學(xué)分型，以制訂下一步的治療方案。但目前國(guó)內(nèi)尚未開展此項(xiàng)技術(shù)，使該類患兒的組織學(xué)分型及外科手術(shù)方式的選擇等方面均面臨一定的困難[9]。

奧曲肽是一種人工合成的生長(zhǎng)抑素類似物，是胰島素釋放的強(qiáng)效抑制劑，可從多因素調(diào)控胰腺β細(xì)胞的功能，在國(guó)外經(jīng)常應(yīng)用于對(duì)二氮嗪治療無(wú)效的CHI患兒[10]。本研究中病例4應(yīng)用奧曲肽試驗(yàn)性治療，結(jié)果患兒對(duì)奧曲肽治療有效，患兒血糖控制良好，無(wú)明顯不良反應(yīng)。上述結(jié)果提示，攜帶ABCC8 R1493Q突變的患兒對(duì)奧曲肽治療有效，可長(zhǎng)期應(yīng)用該類藥物進(jìn)行內(nèi)科治療，從而防止低血糖的發(fā)生。但奧曲肽需要皮下給藥、價(jià)格昂貴，其在國(guó)內(nèi)二氮嗪治療無(wú)效患兒中的應(yīng)用受到一定限制。

ABCC8基因突變根據(jù)功能的不同可分為兩種類型：Ⅰ型突變(classⅠ)，它通過(guò)蛋白的完全丟失或交通缺陷導(dǎo)致細(xì)胞表面鉀通道表達(dá)的減少；Ⅱ型突變(classⅡ)，它破壞了MgADP刺激鉀通道活化的能力，因此阻止了鉀通道被代謝抑制所誘導(dǎo)的活化，該類突變患兒的鉀通道蛋白正常存在，KATP通道卻處于關(guān)閉狀態(tài)。其中以I型突變導(dǎo)致的臨床表型更為嚴(yán)重。某些Ⅱ型突變由于鉀通道對(duì)MgADP有部分反應(yīng),臨床癥狀可表現(xiàn)較輕。本研究病例3攜帶的R1217K突變位于ABCC8基因的第29外顯子區(qū)，病例4攜帶的R1493Q突變位于ABCC8基因的第37外顯子區(qū)，其具體突變類型及致病機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的功能表達(dá)研究來(lái)證實(shí)。

總之，作為CHI的主要類型KATP-CHI有著復(fù)雜的致病機(jī)制，不同的ABCC8突變類型所致的CHI臨床表型存在一定的異質(zhì)性。隨著研究的不斷深入，將有更多的鉀通道致病基因被發(fā)現(xiàn)，這對(duì)于KATP-CHI遺傳發(fā)病機(jī)制的闡明及治療策略的制訂有著重要的理論意義。

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2013-04-03)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.015

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