郭杰芳 高軍 龔燕芳 金晶 吳紅玉 滿曉華 李兆申

·論著·

靶向人轉(zhuǎn)錄因子GLI1基因的RNAi真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

郭杰芳 高軍 龔燕芳 金晶 吳紅玉 滿曉華 李兆申

目的利用pGCsi-U6-GFP質(zhì)粒構(gòu)建干擾人轉(zhuǎn)錄因子GLI1基因的小發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體，并進(jìn)行干擾活性鑒定。方法根據(jù)GenBank中GLI1cDNA的序列，設(shè)計并合成3條GLI1 siRNA，分別克隆至質(zhì)粒載體pGCsi-U6-GFP中構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，擴增后提取質(zhì)粒，行PCR及測序鑒定。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將鑒定正確的3個重組質(zhì)粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3及作為陰性對照質(zhì)粒的pGCsi-U6-GLI1siRNA-C分別與過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-GLI1共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株，48 h后收集細(xì)胞，半定量RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞GLI1 mRNA及蛋白的表達(dá)，鑒定篩選出最佳干擾質(zhì)粒。結(jié)果3個重組質(zhì)粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3均擴增出預(yù)期大小(369 bp)的片段，經(jīng)測序證實與設(shè)計合成的序列完全一致。3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK29細(xì)胞后細(xì)胞GLI1mRNA表達(dá)量分別為0.290±0.011、0.421±0.018、0.373±0.018，蛋白表達(dá)量分別為0.318±0.026、0.433±0.021、0.381±0.018，均顯著低于陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的0.834±0.022及0.818±0.024(P=0.000)。GLI1 mRNA表達(dá)抑制率分別達(dá)65.8%、50.7%、55.7%，蛋白表達(dá)抑制率分別為63.9%、48.3%、53.9%，以pGCsi-U6-GLI1siRNA-1的干擾作用最強。結(jié)論成功構(gòu)建了靶向GLI1的shRNA表達(dá)載體，篩選出具有最佳干擾效果的質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究GLI1基因功能奠定了基礎(chǔ)。

RNA干擾； shRNA； 轉(zhuǎn)錄因子； GLI1基因； Hedgehog信號通路

Hedgehog/GLI1信號通路的過度激活與人胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子GLI1是該通路的重要成員[1]，在該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及致瘤過程中起著非常重要的作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種高效、特異的基因沉默手段[2]。本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向GLI1的RNAi真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究GLI1基因的功能提供技術(shù)手段。

材料與方法

一、GLI1 siRNA的設(shè)計、篩選與小發(fā)夾RNA(shRNA)的合成

根據(jù)GenBank報告的GLI1cDNA全長序列(NM_005269)，利用Qiagen的siRNA設(shè)計軟件，按照Angela原則選出G/C含量在50%左右且符合要求的19-nt序列，進(jìn)行BLAST匹配，從中篩選與GLI1以外的人類已知基因組沒有同源性的3條最佳序列：GLI1siRNA-1：5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3′；GLI1siRNA-2：5′-CCTCTGTCTACTCACCACA-3′；GLI1 siRNA-3：5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3′。對于每條所選定的siRNA序列，設(shè)計、合成兩條shRNA插入模板寡核苷酸單鏈。模板鏈包括siRNA正義鏈與反義鏈，與中間的9個脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)(TTCAAGAGA)相連，后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTT。模板鏈兩端分別設(shè)有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。同時合成陽性對照shRNA(shRNA-C)，shRNA片段由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

二、GLI1 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將兩條模板單鏈與退火緩沖液混勻，置90℃ 4 min、70℃ 10 min、37℃ 20 min、10℃ 30 min使之形成帶黏末端的互補雙鏈shRNA寡核苷酸。pGCsi-U6-GFP質(zhì)粒(上海吉凱基因公司)經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后分別與3個shRNA以1∶58濃度比在T4 DNA連接酶作用下置16℃連接6 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，PCR鑒定。PCR上游引物5′-CAA-GGTCGGGCAGGAAGAG-3′，下游引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。插入shRNA片段的重組質(zhì)粒擴增產(chǎn)物應(yīng)為369 bp，空載體擴增產(chǎn)物應(yīng)為322 bp。經(jīng)PCR鑒定初步正確的重組質(zhì)粒送上海英駿公司測序。測序正確的3個重組質(zhì)粒分別命名為pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3。

三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期HEK 293細(xì)胞(購自中科院細(xì)胞庫)接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液。待細(xì)胞長至約90%融合時采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染。實驗分5組，1～4組分別共轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-GLI1(前期合成)和重組質(zhì)粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3和陰性對照pGCsi-U6-siRNA-C(上海吉凱基因技術(shù)公司，在脊椎動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)不干擾任何內(nèi)源性基因的shRNA)，第5組僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GLI1。各質(zhì)粒DNA量均為4 μg。轉(zhuǎn)染4 h后棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入含5%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

四、轉(zhuǎn)染細(xì)胞GLI1 mRNA檢測

收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，Trizol試劑盒抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行半定量RT-PCR法檢測GLI1 mRNA。GLI1上游引物5′-TGCCTTGTACCCTCCTCC-CGAA-3′，下游引物5′-GCGATCTGTGATGGATGA-GATTCCC-3′，擴增片段284 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，擴增片段185 bp。擴增條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，復(fù)日凝膠成像系統(tǒng)行半定量灰度掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示mRNA表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

五、轉(zhuǎn)染細(xì)胞GLI1蛋白檢測

取轉(zhuǎn)染細(xì)胞，超聲破碎后12 000 r/min離心5 min，取上清，應(yīng)用BCA法檢測總蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測GLI1蛋白，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人GLI1一抗(Santa Crus公司)工作濃度1∶1000，羊抗兔 IgG-HRP二抗工作濃度1∶1000，最后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，光密度掃描系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示蛋白表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、GLI1 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

3個插入GLI1 shRNA片段的重組質(zhì)粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3經(jīng)RT-PCR擴增均擴增出369 bp的片段，與pGCsi-U6-siRNA-C的擴增產(chǎn)物大小一致(圖1)。重組質(zhì)粒送測序分析，確認(rèn)插入片段的序列與設(shè)計合成的shRNA序列完全一致(圖2)。

M：Mark；1：空白對照；2：pGCsi-U6-GFP；3：pGCsi-U6-siRNA-C；4: pGCsi-U6-GLI1siRNA-1；5：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2；6: pGCsi-U6-GLI1siRNA-3

圖1各表達(dá)載體PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

A：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1；B：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2；C：pGCsi-U6-GLI1siRNA-3

圖23個GLI1 shRNA重組質(zhì)粒測序結(jié)果

二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞GLI1 mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3、pGCsi-U6-siRNA-C、pEGFP-N1-GLI1細(xì)胞的GLI1mRNA相對表達(dá)量分別為0.290±0.011、0.421±0.018、0.373±0.018、0.834±0.022、0.839±0.027，相對于轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GLI1的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3的細(xì)胞GLI1 mRNA表達(dá)抑制率分別為65.8%、50.7% 及55.7%(P=0.000，圖3)。其中以轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1的細(xì)胞GLI1 mRNA的表達(dá)抑制率最高。

1：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1組；2：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2組；3：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-3組；4：pGCsi-U6-siRNA-C組；5：pEGFP-N1-GLI1組

圖3各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GLI1mRNA的表達(dá)

三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞GLI1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3、pGCsi-U6-siRNA-C、pEGFP-N1-GLI1-NC細(xì)胞的GLI1蛋白相對表達(dá)量分別為0.318±0.026、0.443±0.021、0.381±0.018、0.818±0.024、0.831±0.031，相對于轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GLI1的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-3的細(xì)胞GLI1蛋白表達(dá)抑制率分別為63.9%、48.3% 、53.9%(P值均=0.000，圖4)，其中以轉(zhuǎn)染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1細(xì)胞的表達(dá)抑制率最高，與RT-PCR的結(jié)果相一致。

1：pGCsi-U6-GLI1siRNA-1組；2：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2組；3：pGCsi-U6-GLI1siRNA-3組；4：pGCsi-U6-siRNA-C組；5：pEGFP-N1-GLI1-組

圖4各組細(xì)胞GLI1蛋白的相對表達(dá)量

討 論

近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路的異常激活與人胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。Thayer等[4]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠胰腺內(nèi)胚層異常表達(dá)Hedgehog信號通號的上游成員SHH，結(jié)果胰腺上皮出現(xiàn)類似上皮內(nèi)瘤變的異常管狀結(jié)構(gòu)，且這些異常管狀結(jié)構(gòu)含有K-ras基因突變及HER-2/neu的過度表達(dá)，提示該通路與胰腺癌的癌前病變密切相關(guān)。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，5株人胰腺癌細(xì)胞株均不同程度表達(dá)Hedgehog信號通路的GLI1及PTCH1，胰腺癌組織中PTCH、SMO、GLI1的表達(dá)水平及表達(dá)陽性率均顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織[5-7]。這些結(jié)果均表明，Hedgehog通路在胰腺癌的發(fā)生及惡性生物學(xué)特性的維持中起著非常重要的作用。GLI1作為該通路末端具有很強活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，它直接調(diào)控著靶基因的轉(zhuǎn)錄，在該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。因此，深入研究GLI1基因的功能將有助于探討Hedgehog通路在致胰腺癌中的作用機制。

近年來發(fā)展迅速的RNAi技術(shù)因其高特異性、高效性、作用迅速等特點，在腫瘤的基因功能研究方面展現(xiàn)出了不可比擬的優(yōu)勢[8-9]。RNAi技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何高效地將siRNA導(dǎo)入靶組織或細(xì)胞并使之發(fā)揮長期、穩(wěn)定的抑制作用[10]。以往獲得siRNA的方法主要有體外制備及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄兩種，但這兩種方法獲得siRNA性質(zhì)不穩(wěn)定，易被RNA酶降解，抑制作用短暫，且體外合成的siRNA的量往往也不能滿足體內(nèi)實驗的要求，因此應(yīng)用價值有限。而siRNA表達(dá)載體性質(zhì)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染率較高，在細(xì)胞內(nèi)能較長時間表達(dá)siRNA，干擾效果較持久，故在腫瘤基因研究中潛力更大[11]。

為了進(jìn)一步探討GLI1在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，將GLI1作為研究靶點，設(shè)計3條針對GLI1基因的siRNA序列，并合成shRNA寡核苷酸鏈，將其定向克隆入pGCsi-U6-GFP質(zhì)粒，經(jīng)RT-PCR及測序分析，證實靶向干擾GLI1基因的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后GLI1mRNA及蛋白的表達(dá)均被抑制，以pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1質(zhì)粒的抑制作用最顯著，為后續(xù)研究GLI1基因的功能及深入探討Hedgehog/ GLI1信號通路在胰腺癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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ConstructionandidentificationofRNAieukaryoticexpressionvectorstargetinghumantranscriptionfactorglioma-associatedoncogenehomolog1

GUOJie-fang,GAOJun,GONGYan-fang,JINJing,WUHong-yu,MANXiao-hua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo construct RNAi eukaryotic expressing vectors of human transcription factor glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) with pGCsi-U6-GFP plasmid and to identify its activity in interfering GLI1.MethodsThree GLI1siRNA targeting GLI1 were designed and synthesized according to the GLI1cDNA sequence in GeneBank, and then were cloned into pGCsi-U6-GFP to construct the recombinant plasmids, and transformed into E.coli DH5a, then it was amplified and plasmids were extracted, which were further confirmed by PCR reaction and DNA sequencing. pGCsi-U6-siRNA-C was negative as control wector. Then recombinant plasmids pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 pGCsi-U6-siRNA-C and a eukaryotic over-expression vector pEGFP-N1-GLI1 were co-transfected into HEK293 cells by Lipofectamine 2000 respectively. The cells were collected at 48 h after transfection. Semi-quantitative RT-PCR and Western Blot were performed to detect the expression of GLI1 mRNA and protein to screen the optimal vector which had the best interfering effect.ResultsA 369 bp fragment was amplified from all three recombinant plasmids, (pGCs-U6-GLI1siRNA-1,pGCs-U6-GLI1siRNA-2,pGCs-U6-GLI1siRNA-3),showing that synthesized shRNA oligonucleotide fragments were correctly inserted into three recombinant plasmids, which were further confirmed by sequencing. Expression levels of GLI1mRNA and protein in cells in pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 were 0.290±0.011,0.421±0.018,0.373±0.018,and 0.318±0.026,0.443±0.021,0.381±0.018, which were significantly lower than those in negative control group (0.834±0.022,0.818±0.024,P=0.000), the inhibitory rates were 65.8%,50.7%,55.7%, and 63.9%,48.3%,53.9%. The interfering efficacy of pGCs-U6-GLI1siRNA-1 was the strongest among the three recombinant plasmids.ConclusionsRNAi eukaryotic vectors pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 are successfully constructed and the optimal vector is identified, and this can provide a solid experimental foundation for further functional study of GLI1 gene.

RNA interference； Short hairpin RNA； Transcription factor； GLI1 genes； Hedgehog signaling pathway

2013-01-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.011

國家自然科學(xué)基金(81101575)；上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類項目(114119a6700)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Emial：zhsli@81890.net