趙鑫 張光波 李智 干文娟 朱東明 趙華 張子祥 李德春

·論著·

靶向B7-H3基因RNA干擾慢病毒的構(gòu)建及人胰腺癌PaTu8988穩(wěn)定感染細(xì)胞株的建立

趙鑫 張光波 李智 干文娟 朱東明 趙華 張子祥 李德春

目的構(gòu)建靶向人B7同源性3(B7-H3)基因的小發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒載體，并建立穩(wěn)定感染的胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株。方法根據(jù)GenBank提供的B7-H3 cDNA序列，設(shè)計(jì)4條靶向B7-H3的siRNA序列，構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA。將重組干擾質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)B7-H3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法篩選出干擾效果最佳的重組干擾質(zhì)粒。該質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝，并感染胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株，建立穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3細(xì)胞株。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞B7-H3基因的表達(dá)抑制率。結(jié)果攜帶干擾效果最好的shRNA的慢病毒感染PaTu8988細(xì)胞，建立了穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3基因的PaTu8988細(xì)胞株，其B7-H3 mRNA表達(dá)的抑制率達(dá)96.8%，B7-H3蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)88.1%。結(jié)論成功構(gòu)建了人B7-H3-RNAi的慢病毒載體，并建立了穩(wěn)定感染的低表達(dá)B7-H3基因的PaTu8988細(xì)胞株。

胰腺腫瘤； B7-H3； RNA干擾； 慢病毒感染

B7同源性3(B7 Homolog 3, B7-H3)分子是T細(xì)胞共刺激分子B7-CD28家族的新成員，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向B7-H3基因的小分子RNA干擾(siRNA)序列，構(gòu)建表達(dá)人B7-H3-shRNA的慢病毒載體，并建立穩(wěn)定的人胰腺癌PaTu8988感染細(xì)胞株?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、B7-H3干擾序列插入載體pGCSIL-GFP

根據(jù)B7-H3(NM_001024736)基因序列設(shè)計(jì)4條靶向B7-H3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，siRNA1：5′-CAGCTGACAGATACC-AAACAG-3′；siRNA2：5′-CAAAGAAGATGATGGACA-AGA-3′；siRNA3：5′-CTCTGAAACACTCTGACAGCA-3′；siRNA4：5′-GAGCAGGGCTTGTTTGATGTG-3′。據(jù)此設(shè)計(jì)相應(yīng)互補(bǔ)的單鏈DNA，按5p向3p順序依次為：酶切位點(diǎn)(Age I)、siRNA正向序列、Loop環(huán)(CTCGAG)、siRNA反向互補(bǔ)序列、終止信號(hào)(TTTTT)、酶切位點(diǎn)(EcoR I)。另設(shè)計(jì)1條用于陰性對(duì)照的無(wú)關(guān)序列siRNA-C，通過(guò)BLAST驗(yàn)證該序列對(duì)于任何基因無(wú)干擾效應(yīng)。所有小發(fā)夾RNA(shRNA)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司合成。

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Age I和EcoR I雙酶切空載體pGCSIL-GFP(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司)，分別與稀釋和退火后的4種shDNA及shRNA-C進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)染用氯化鈣制備的新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布加氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以不加載體及加空載體為對(duì)照。挑取平板上的菌落，使用載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落。多克隆位點(diǎn)兩端的引物序列為：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′；5′-GTAATA-CGGTTATCCACGCG-3′。陽(yáng)性克隆再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

二、293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞(ATCC公司)培養(yǎng)于24孔板，當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)換成400 μl的Opti-MEM1，分為空白對(duì)照組、shRNA-C組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNA4組?？瞻讓?duì)照組為單純293T細(xì)胞組，其他各組采用脂質(zhì)體方法分別將插入相應(yīng)shRNA的重組干擾質(zhì)粒及過(guò)表達(dá)B7-H3的質(zhì)粒pEGFP-N1-B7-H3-3FLAG-GFP(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，每孔加過(guò)表達(dá)載體0.5 μg，重組干擾質(zhì)粒0.4 μg，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)2 μl。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染效果，36 h后收集細(xì)胞，抽提蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Flag蛋白的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。蛋白質(zhì)印跡法試劑盒購(gòu)自上海生工公司，按說(shuō)明書(shū)操作。鼠抗Flag抗體購(gòu)自Sigma公司，鼠抗GAPDH抗體、羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。以此選擇干擾效果最佳的shRNA序列。

三、慢病毒重組體的包裝

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以1.2×107個(gè)細(xì)胞的密度接種于15 cm的培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。在滅菌離心管中加入干擾效果最佳的重組干擾質(zhì)粒20 μg或shRNA-C陰性對(duì)照質(zhì)粒20 μg，輔助質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0載體各10 μg，加Opti-MEM 混勻，調(diào)整總體積為2.5 ml，在室溫下溫育5 min。在另一試管中加100 μl Lipofectamine 2000及2.4 ml Opti-MEM混勻。將前述兩管混合，室溫溫育20 min，轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集病毒上清液，于4℃ 4000×g離心10 min，再用直徑為0.45的PVDF濾膜過(guò)濾后分裝，用于病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞感染。

四、慢病毒感染PaTu8988細(xì)胞

PaTu8988細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自國(guó)外引進(jìn)并保存，常規(guī)培養(yǎng)，以5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合達(dá)30%時(shí)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組，不加或分別加入1.5×109Tu/ml的相應(yīng)慢病毒4 μl(MOI:20)及Polybrene感染細(xì)胞12 h，棄培養(yǎng)基，加入2 ml含有10% FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，觀察帶熒光的慢病毒感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率。再經(jīng)sorting流式細(xì)胞儀分選感染細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞GFP陽(yáng)性表達(dá)率。

五、感染細(xì)胞株B7-H3 mRNA和蛋白檢測(cè)

取上述3組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)收集細(xì)胞。按照Trizol法提取細(xì)胞總RNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)B7-H3的表達(dá)。B7-H3引物序列上游5′-CTCTGCCTTCTCACCTCTTTG-3′，下游5′-CCTTGAGGGAGGAACTTTATC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度134 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列上游5′-TGACTT-CAACAGCGACACCCA-3′，下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度121 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值，制作熔解曲線。PCR結(jié)束后，95℃變性1 min，然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合，從55℃開(kāi)始每4 s增加0.5℃，直到95℃，同時(shí)讀取吸光值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算B7-H3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

取上述3組細(xì)胞，應(yīng)用康成公司的蛋白抽提試劑盒提取各組細(xì)胞的總蛋白， BCA法定量蛋白后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)B7-H3蛋白，以GAPDH為內(nèi)參照。鼠抗人B7-H3單抗購(gòu)自Bio Legend公司。ECL顯色、曝光、顯影后，采用灰度分析軟件半定量計(jì)算B7-H3蛋白表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒的鑒定

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增，均獲得343 bp的條帶，轉(zhuǎn)染空載體的PCR擴(kuò)增條帶片段為306 bp(圖1)。經(jīng)測(cè)序，4個(gè)靶向B7-H3基因的shRNA重組質(zhì)粒的shRNA編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，表明重組干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

1：陰性對(duì)照組；2：空載體組；M：Maker；N：shRNA-C組；3～6：shRNA1、2、3、4組

圖1各組陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒擴(kuò)增片段

二、最佳干擾質(zhì)粒的篩選

因293T細(xì)胞不表達(dá)Flag，而重組B7-H3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒是將目的基因B7-H3與Flag融合表達(dá)的，轉(zhuǎn)染重組干擾質(zhì)粒的干擾效果通過(guò)Flag的表達(dá)抑制體現(xiàn)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，各組熒光細(xì)胞數(shù)均在80%以上，36 h后的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示shRNA4重組干擾質(zhì)粒的干擾效果最佳(圖3)，確定用該干擾質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝。

三、穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的PaTu8988細(xì)胞株的建立

重組慢病毒感染PaTu8988細(xì)胞，經(jīng)sorting流式細(xì)胞儀分選純化提高陽(yáng)轉(zhuǎn)細(xì)胞比例，即獲穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的PaTu8988細(xì)胞株。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，GFP陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)96.8%(圖4)。穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的PaTu8988細(xì)胞的B7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)較shRNA-C組和空白對(duì)照組顯著下調(diào)，mRNA的抑制率達(dá)96.8%，蛋白抑制率達(dá)88.1%(圖5)。

a～d：shRNA1、2、3、4重組的質(zhì)粒

圖3 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Flag蛋白表達(dá)

圖4穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的PaTu8988細(xì)胞 (a：熒光顯微鏡 ×200)及其GFP表達(dá)(b：流式細(xì)胞儀)

圖5各組慢病毒感染后PaTu8988細(xì)胞的B7-H3蛋白表達(dá)

討 論

T細(xì)胞活化除需要T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一信號(hào)外，還需要協(xié)同刺激分子轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信號(hào)。B7-H3為新發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子中的成員，具有正向或負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞的作用[1-4]。B7-H3在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)且是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3在腫瘤中可能作為一種免疫逃逸通路存在，其表達(dá)導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的下調(diào)[10]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，B7-H3高表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[11-12]。因此推斷B7-H3在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中也可能發(fā)揮著復(fù)雜的作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

近年發(fā)展起來(lái)的RNAi干擾技術(shù)具有高效性、穩(wěn)定性、可傳遞性、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。而且慢病毒載體不僅具有毒力低、轉(zhuǎn)染效率高、可轉(zhuǎn)染不同時(shí)相細(xì)胞、能夠攜帶大片段基因的優(yōu)點(diǎn)，更重要的是能將目的基因整合到宿主細(xì)胞染色體中，并在子代中穩(wěn)定表達(dá)，且具有較好的生物安全性[13-14]。本研究先從4個(gè)靶向B7-H3基因的shRNA中篩選出干擾效果最佳的shRNA序列，繼而構(gòu)建RNA干擾重組慢病毒感染人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)aTu8988，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選，獲得了穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的細(xì)胞株，B7-H3 mRNA的表達(dá)抑制率達(dá)96.8%，蛋白表達(dá)抑制率達(dá)88.1%，為進(jìn)一步研究B7-H3基因在胰腺癌發(fā)病及進(jìn)展中的作用及其機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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ConstructionofB7H3RNAilentiviralvectorandestablishmentofitsstablyinfectedhumanpancreaticcancerPaTu88cellline

ZHAOXin,ZHANGGuang-bo,LIZhi,GANWen-juan,ZHUDong-ming,ZHAOHua,ZHANGZi-xiang,LIDe-chun.

DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006,China

Correspondingauthor：LIDe-chun,Email:dechunli.soochowedu@yahoo.cn

ObjectiveTo construct the B7-H3-RNAi lentiviral vector and establish a stably infected human pancreatic cancer PaTu88 cell line.MethodsAccording to genetic information of B7 H3 cDNA sequence provided by GenBank, 4 siRNA sequence targeting B7-H3 were designed. The corresponding pGCSIL-GFP recombinant plasmids (pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA) were constructed. Then both recombinant interference plasmid and over-expressing B7-H3 plasmid (pEGFP-N1-H3-1FLAG-GFP) were transfected into 293T cells. Western blot was used to detect the recombinant interference plasmid with best effect of interference. Then this plasmid underwent lentiviral packaging and was infected into PaTu8988 cells and a stably low-expression of B7-H3 cell line was established. Real-time quantitative PCR and Western blot were applied to measure the expression inhibition rate of B7-H3.ResultsLentiviral with the best gene silencing effect shRNA was infected into PaTu8988 cell line, and a PaTu8988 cell line, stably low-expressing B7-H3, was established, and the inhibitive rate of B7-H3 mRNA and protein expression were 96.8% and 88.1%, respectively.ConclusionsB7-H3-shRNA lentiviral vector is successively constructed and pancreatic cancer Patu8988 cell line which can stably low-express B7-H3 is established.

Pancreatic neoplasms； B7-H3； RNA interference； Lentivirus infections

2012-10-08)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.009

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001138)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(CXZZ11_0125)；蘇州市科技計(jì)劃(SYS201120)；蘇州大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文選題立項(xiàng)(2011一般資助-14)

215006 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科(趙鑫、朱東明、趙華、張子祥、李德春)，介入科(李智)，病理科(干文娟)；臨床免疫研究室，江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省臨床免疫研究所(張光波)

李德春，Email: dechunli.soochowedu@yahoo.cn