吳麗霞 梁翠霞 廖樂(lè)樂(lè) 吳鐵松

1.廣東省深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518110；2.廣東省深圳流花醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518002

三七（Panax Notoginseng）為五加科人參屬草本植物，是我國(guó)珍貴的特產(chǎn)中藥，有著悠久的用藥歷史。皂苷是三七最主要的生物活性成分，具有散瘀止血、消腫定痛等功效[1－2]。目前，提取三七中皂苷成分的方法有水煎煮法、醇回流法、大孔吸附樹(shù)脂法、微波提取法、超聲提取法、超臨界萃取等[3]。上述方法技術(shù)較為成熟，但存在或提取率低，或提取物生物活性差，或處于實(shí)驗(yàn)研究階段難以大規(guī)?；纳a(chǎn)等缺點(diǎn)。因此，新技術(shù)的開(kāi)發(fā)是我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略需求，同時(shí)也是中藥現(xiàn)代化道路上不斷探索的熱點(diǎn)課題。

加壓提取技術(shù)[4]是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興提取技術(shù)，其原理是在密閉容器內(nèi)，通過(guò)升高壓力使提取溶劑在超過(guò)沸點(diǎn)的溫度下仍保持液體狀態(tài)。在中藥提取過(guò)程中，通過(guò)施加一定的壓力，使藥材內(nèi)部的細(xì)胞壁被破壞從而加速溶劑的擴(kuò)散；同時(shí)，升高壓力還能使溶劑在高于沸點(diǎn)情況下仍保持液體狀態(tài)，改善溶劑的溶解性和選擇性，從而提高浸出速度和浸出率，縮短提取時(shí)間，減少溶劑損耗[5]。

本文擬采用加壓提取技術(shù)，從三七中提取皂苷成分，通過(guò)對(duì)提取壓力、溫度、時(shí)間、料液比、乙醇濃度、藥材粒徑等工藝參數(shù)的研究，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化軟件，得出最優(yōu)回歸方程及最佳提取工藝參數(shù)，并與加熱回流提取法進(jìn)行比較，探討加壓提取技術(shù)對(duì)三七皂苷物氧化活性及抑菌活性的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

采用美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters2695/2996型高效液相色譜儀，瑞士Foss Tecator公司生產(chǎn)的1095knifetec樣品研磨機(jī)，美國(guó)Dionex公司生產(chǎn)的ASE200型溶劑加速提取儀，上海亞榮生化儀器廠RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的GZX－9070MBE型干燥箱、Spx－250B－Z生化培養(yǎng)箱，上海分析儀器廠生產(chǎn)的UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 試藥

三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：870－200001）；人參皂苷Rb1（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110704－200216）；人參皂苷 Rg1（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0703－2000221）；乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純，乙醚、香草醛為分析純；DPPH（美國(guó)sigma公司）；三七藥材購(gòu)自云南文山；大腸桿菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌來(lái)自廣東省深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 加壓提取與加熱回流提取

加壓溶劑提取取三七藥材粉碎成粗粉，準(zhǔn)確稱定40 g，置加壓提取裝置，取400 mL蒸餾水，在溫度110℃、壓力0.3 MPa下加壓浸提30 min，濃縮藥液到135 mL，醇沉濃度到60%，靜置取上清液揮干；加熱回流提取同樣取三七藥材粗粉40 g，加蒸餾水回流提取3次，劑量200 mL，合并濾液濃縮醇沉到60%，靜置取上清液揮干。

2.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確量取三七粉3.0 g，加壓溶劑提取，取提取液11 mL到25 mL容量瓶中，定容取液1 mL于試管中，正丁醇萃取3次，合并萃取液，水浴揮干，加0.2 mL香草醛－冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，60℃加熱15 min，冰水浴冷卻后加5 mL冰醋酸，用光度計(jì)測(cè)定吸收度，以甲醇作空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)547 nm處測(cè)定吸光值，得到回歸方程：Y=4.2008X－0.0009，相關(guān)系數(shù) r=0.9992。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取13 mg三七總皂標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，采用甲醇溶解。取1.0 mL置于試管中，同樣加入香草酸冰醋酸及高氯酸，在400～900 nm用紫外分光光度計(jì)掃描。

總皂苷提取收率（%）=0.0198（V/V1）（l/m）×100%

V表示提取液總體積（mL）；V1表示檢測(cè)時(shí)所提取體積（mL）；m 表示三 t質(zhì)量（g）。

2.4 抗氧化活性測(cè)定

取提取物用甲醇稀釋搖勻待測(cè)，分別配置成2.5 mL 1，1－苯基－2=三硝基苯肼（DPPH）溶液+1.5 mL 甲醇、2.5 mL DPPH溶液+1.5 mL待測(cè)樣品甲醇溶液、2.5 mL甲醇溶液+1.5 mL待測(cè)櫚甲醇溶液，室溫靜置30 min，在514 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，均取3次平均值。

清除率：Y=（1－ ）×100%

A0表示未加樣品溶液DPPH溶液吸光度；Ai表示加入樣品溶液后DPPH溶液吸光度；Aj表示表示DPPH溶液與樣品溶液混合后的吸光度。

2.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

參照周德慶《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[6]制備菌懸液和培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上等距離找孔，加入藥液，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測(cè)定抑菌圈直徑大小，進(jìn)行抑菌效果比較。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三七皂苷單因素參數(shù)

設(shè)計(jì)不同壓力、溫度、料液比、乙醇濃度、藥材粒徑等參數(shù)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。

表1 三七皂苷提取率單因素參數(shù)水平

3.2 壓力對(duì)三七皂苷提取率的影響

在溫度120℃、料液比1∶20、時(shí)間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑 80 目的參數(shù)條件下，選取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 MPa不同壓力，考查壓力對(duì)三七皂苷提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，隨著壓力的升高，三七皂苷提取率的提取也逐步增加，當(dāng)壓力增加到0.8 MPa時(shí)，提取率為最高值8.62%，從0.8～1.0 MPa，提取率略有下降，故適宜壓力條件應(yīng)為0.8 MPa。

3.3 溫度對(duì)三七皂苷提取率的影響

在維持壓力 0.8 MPa、料液比 1∶20、時(shí)間 15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目的條件下，設(shè)定溫度為100、110、120、130、140、150℃，考查溫度對(duì)三七皂苷提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，隨著溫度的升高，三七總皂苷的提取率也逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到140℃時(shí)，提取率達(dá)到一個(gè)最大值，從140℃到達(dá)150℃時(shí)，提取率基本維持恒定，因此適宜溫度條件應(yīng)為140℃。

同理在設(shè)定壓力、溫度等一定值的條件下，考查料液比、時(shí)間、乙醇濃度、藥料粒徑對(duì)三七總皂苷提取率的影響，可以看出適宜的工藝條件分別為：液比1∶20、時(shí)間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。

3.4 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)本文對(duì)加壓撮與加熱回流提取法的比較，本文在假定料液比、乙醇濃度、藥料粒徑恒定的情況下，考查壓力、濕度、時(shí)間對(duì)三七總皂苷提取率的影響，采用均勻設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表2 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析功能可以得到三七皂苷有關(guān)提取率與壓力、溫度、時(shí)間的回歸方程。以Y代表三七皂苷總提取率，X1表示提取壓力，X2表示提取溫度，X3表示提取時(shí)間，回歸方程如下：

Y=3.284 780 5+0.007 742X1+0.062 748 2X2+0.035 245 7X3－0.000 003 8－0.000 078 6X1X3－0.000 856 4+0.000 235 4X2X3

同時(shí)，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)軟件分析，可以得到三七總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)是：壓力0.8 MPa、溫度120℃、料液比1∶20、時(shí)間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。提取得率的預(yù)測(cè)區(qū)間為3.74%～8.55%。

3.5 最佳提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)軟件得出的最佳提取工藝參數(shù)連續(xù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，三七總皂苷提取率分別為71.35%、73.68%、72.41%，平均提取率為72.48%，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果非常接近，重復(fù)性也很好，表明優(yōu)化結(jié)果具有可靠性。

3.6 加壓提取與加熱回流提取比較

加壓提取法提取時(shí)間顯著低于加熱回流法（P＜0.01），三七總皂苷加壓提取率明顯高于加熱回流提取率（P＜0.05），兩種方法清除率、抑菌活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 加壓提取與加熱回流提取相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 加壓提取與加熱回流提取相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

方法 時(shí)間（min）加壓提取加熱回流提取t/χ2值P值15.12±3.14 312.25±85.41 12.654＜0.01提取率（%）清除率（%）抑菌圈直徑（mm）大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草桿菌 四聯(lián)球菌73.14±8.65 52.32±6.54 6.241＜0.05 91.82±9.86 91.20±10.21 0.732＞0.05 16.56±3.14 18.12±4.21 0.921＞0.05 15.02±4.25 16.15±5.23 0.873＞0.05 16.25±3.47 17.21±4.26 0.824＞0.05 15.26±3.62 17.12±35.24 0.856＞0.05

4 討論

三七主要活性成分為皂苷類，根據(jù)《中國(guó)藥典》2000年版規(guī)定，三七藥材人參皂苷（Rg1+Rb1）不少于3.8%，總皂苷和人參皂苷評(píng)價(jià)提取三七皂苷類成分提取效果的指標(biāo)[7，8]。溫度、壓力、提取時(shí)間是影響提取效率的主要因素[9]。在一定的范圍內(nèi)，溫度升高會(huì)提高溶劑的溶解性能，加快分子擴(kuò)散速度，影響表面平衡，從而加速提取過(guò)程中的質(zhì)量轉(zhuǎn)移[10]加壓溶劑提取能夠提供吸附過(guò)程中的活化能，降低待測(cè)物和基質(zhì)物的交互作用，同時(shí)降低溶劑的黏度和表面張力，提高滲透性能，同時(shí)必須注意的是溫度與壓力控制的相關(guān)性[11]，壓力控制就是為了保持溶劑處于液體狀態(tài)，從而保證提取的順利進(jìn)行[12]。

植物活性成分非常復(fù)雜，不同物質(zhì)提取工藝不同[13]。趙文英等[14]通過(guò)加壓提取法與乙醇回流提取法的比較研究，證實(shí)在相同藥材粒徑和料液比的情況下，加壓提取法設(shè)定壓力500 kPa、溫度130℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、粒徑600目時(shí)，加壓提取法具有省時(shí)和高效的優(yōu)點(diǎn)。本文研究表明，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)軟件分析，三七總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)是：壓力 0.8 MPa、溫度 120℃、料液比 1∶20、時(shí)間 15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。提取得率的預(yù)測(cè)區(qū)間為：3.74%～8.55%。通過(guò)對(duì)加壓提取和加熱回流提取的比較研究可以發(fā)現(xiàn)，加壓提取法三七總皂苷提取率[（73.14±8.65）%]明顯高于加熱回流提取[（52.32±6.54）%]（P ＜ 0.05），提取時(shí)間[（15.12±3.14）min]顯著低于加熱回流法[（312.25±85.41）min]（P＜0.01），兩種方法清除率、抑菌活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。楊薇薇等[15]通過(guò)對(duì)三葉草總異黃酮采用加壓提取技術(shù)與加熱回流提取法的對(duì)比研究，在優(yōu)化提取工藝參數(shù)后，加壓提取紅三葉草總異黃酮得率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57.0 mg/g和8.85%，明顯高于加熱回流法。

綜上所述，加壓提取技術(shù)通過(guò)對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化，能夠提高三七皂苷物有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，不影響皂苷類成分抗氧化活性和抑菌活性，而且重復(fù)性好，操作模式多樣化，操作過(guò)程自動(dòng)化，適宜于三七皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

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