楊曉暉 梁金環(huán) 尹 瑋

滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州 061001

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是嚴(yán)重威脅人類健康的常見內(nèi)分泌代謝疾病，肝臟作為長期受高血糖刺激的臟器之一，肝臟與糖尿病的關(guān)系逐漸受到人們重視。糖尿病肝病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。糖尿病屬祖國醫(yī)學(xué)消渴證，陰虛為本[1]。養(yǎng)陰活血方藥是經(jīng)多年研究和臨床試驗的核心方劑[2]。琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一[3]。三磷酸腺苷酶（ATP酶）是維持胞內(nèi)離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和神經(jīng)元興奮性、沖動傳導(dǎo)、突觸傳遞的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為葡萄糖和氨基酸的攝取提供驅(qū)動力，維持細(xì)胞生命活動，也是反映線粒體功能的重要酶之一[3-4]。本研究在線粒體水平研究糖尿病大鼠肝臟的損傷作用，并且觀察糖尿病大鼠肝臟線粒體中ATP酶和SDH活性的變化。同時采用養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠進(jìn)行治療，研究其對糖尿病肝病的防治作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級健康雄性SD大鼠，體重為250～300 g，24只，由河北省實驗動物中心提供（動物合格證編號：809091）。

1.2 中藥配方

養(yǎng)陰活血方藥組成：熟地20 g、牡丹皮20 g、山藥15 g、山茱萸10 g等。

1.3 主要儀器及試劑

血糖檢測儀（購于強(qiáng)生公司），3K-15型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司），7200型可見分光光度計（上海尤尼柯公司），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma 公司），線粒體提取試劑盒（批號 20090809）、ATP 酶測定試劑盒（批號 20090710）、SDH測定試劑盒（批號20090710）均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 4月齡健康雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為三組：正常對照組（8只）；糖尿病模型組（8 只）；中藥干預(yù)組（8 只）。

1.4.2 糖尿病動物模型制備及給藥 除正常對照組外，其他兩組腹腔注射STZ造糖尿病模型。各組正常飼料喂養(yǎng)，正常對照組和糖尿病模型組自由飲水，中藥干預(yù)組按人與動物間體表面積折算的等效劑量比值灌喂給藥。

1.4.3 取材 造模成功后10周，對各組大鼠進(jìn)行稱重，股動脈放血，并取肝臟，部分進(jìn)行固定，其余立即放入液氮，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 ATP酶和SDH活性的測定 取一小塊肝組織，稱重，用勻漿介質(zhì)制成10%組織勻漿，提取線粒體，然后測SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 取肝組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，用4%戊二醛進(jìn)行固定，磷酸緩沖液浸洗3次，每次10 min，然后用鋨酸（10 g/L）固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋，切片，染色，然后在電鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝線粒體ATP酶和SDH活性測定結(jié)果

與正常對照組比較，糖尿病模型組的SDH活性明顯降低，Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低（P＜0.01）。見表1。與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均有顯著升高（P ＜ 0.01）。 見表2。

表1 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（糖尿病模型組與正常對照組）（U/mgprot，±s）

表1 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（糖尿病模型組與正常對照組）（U/mgprot，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

組別 只數(shù)SDH Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶正常對照組糖尿病模型組88 3.91±0.43 2.31±0.27*2.39±0.28 0.57±0.18*2.18±0.09 0.95±0.19*

表2 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（中藥干預(yù)組與糖尿病模型組）（U/mgprot，±s）

表2 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（中藥干預(yù)組與糖尿病模型組）（U/mgprot，±s）

注：與糖尿病模型組比較，*P＜0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

?組別 只數(shù)SDH Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶糖尿病模型組中藥干預(yù)組88 2.31±0.27 3.39±0.29*0.57±0.18 1.70±0.22*0.95±0.19 1.75±0.09*

2.2 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

通過觀察透射電鏡下（×15 000）肝組織，與正常對照組比較，糖尿病模型組可見肝細(xì)胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，脫顆粒現(xiàn)象明顯。中藥干預(yù)組肝細(xì)胞線粒體無空泡，但是線粒體嵴和膜不清晰。而正常對照組肝細(xì)胞線粒體完整，線粒體嵴清晰。見圖1。

3 討論

糖尿病是一種新陳代謝疾病，以慢性高血糖為特征，因胰島素分泌、胰島素活性異常所致；糖尿病患者經(jīng)常伴有高脂血癥，心血管病病死率高[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2011年全球有近三億六千四百萬人罹患糖尿病。2004年全世界有340萬人因高血糖致死[7]。

肝臟是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場所，細(xì)胞生命活動大約95%的能量來自線粒體[8]；線粒體的一個重要生物學(xué)功能是氧化代謝和鈣代謝，其正常運行依賴于結(jié)構(gòu)的完整性。線粒體的氧化磷酸化功能與鈣平衡狀態(tài)密切相關(guān)。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶對調(diào)節(jié)線粒體膜內(nèi)外的離子平衡至關(guān)重要，其活性依賴于膜流動性并受ATP水平的影響[9]。細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降，必然會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+超載，進(jìn)而引起線粒體中的Ca2+釋放和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；Mg2+-ATP酶活性下降則導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Mg2+減少，削弱Mg2+-ATP酶對Ca2+超載的生理拮抗作用，抑制蛋白質(zhì)和能量合成，降低多種酶的活性，增加細(xì)胞膜的通透性，造成了離子分布狀態(tài)失衡和水積聚，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷和死亡。高血糖和血脂成分的變化造成膜酶的糖化，致使Na+-K+-ATP酶活性降低[10]，也會致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，組織細(xì)胞凋亡。

SDH是嵌在線粒體內(nèi)膜上的一種多聚體酶，具有雙重作用；一是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵性脫氫酶，二是氧化磷酸化以及把電子直接傳遞給輔酶Q10的呼吸鏈的重要組分。SDH氧化琥珀酸形成三羧酸循環(huán)組分之一的延胡索酸，其氧化輔酶Q10形成線粒體電子傳遞鏈里的泛醇[11]。SDH活性的變化可反映細(xì)胞能量代謝情況和三羧酸循環(huán)狀態(tài)[12]，該酶活性的升高表明線粒體經(jīng)由短呼吸鏈中ATP產(chǎn)生的增加以及三羧酸循環(huán)的加快[13]；SDH活性增強(qiáng)時，琥珀酸受體的表達(dá)下降；而SDH活性逐漸降低時，琥珀酸受體表達(dá)則隨之顯著升高[14]。SDH是檢測線粒體損傷程度的敏感指標(biāo)[15]。

實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，糖尿病模型組的鈉鉀ATP酶與鈣鎂ATP酶活性明顯降低，SDH活性明顯降低，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，模型組可見肝細(xì)胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，脫顆?，F(xiàn)象明顯。這說明糖尿病使肝臟中線粒體損傷程度嚴(yán)重，表明糖尿病對肝臟會造成功能性損傷。

經(jīng)過10周的飼養(yǎng)，模型組大鼠肝臟線粒體SDH及ATP酶活力均有大幅降低，說明長期糖尿病可引起肝臟線粒體功能衰減，有可能引起肝組織線粒體鈉-鉀泵、鈣-鎂泵及呼吸鏈功能障礙，從而引起糖尿病肝病。有資料顯示，中藥可以治療糖尿病并發(fā)癥[16]。研究結(jié)果表明，與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均有顯著升高，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞線粒體無空泡，損傷程度較輕，說明此配方中藥對糖尿病患者的肝臟線粒體損傷有明顯的防治作用。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)中“消渴病”范疇，病因多為陰傷所致，本實驗所用養(yǎng)陰活血方藥由熟地、牡丹皮、山藥、山茱萸等中藥組成。其中熟地可滋陰補(bǔ)血，山萸肉可滋補(bǔ)肝腎，諸藥并用以奏養(yǎng)陰活血之功。研究結(jié)果表明，養(yǎng)陰活血方藥可有效提高SDH和ATP酶活性，這可能是養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟線粒體的保護(hù)作用機(jī)制之一。

[1]梁金環(huán)，栗彥寧，齊錦生，等.養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].中國中藥雜志，2008，33（14）：1728-1731.

[2]齊錦生，李恩，薛智權(quán)，等.滋陰補(bǔ)腎方藥對糖尿病大鼠骨中一氧化氮合酶 mRNA 表達(dá)的影響[J].中醫(yī)雜志，2003，44（5）：379.

[3]肖凱，王慶松.PTSD樣情感行為異常大鼠腦組織ATP酶活性改變[J].西南國防醫(yī)藥，2002，12（3）：204-206.

[4]范穎，李楠，孫云峰，等.黃芪有效部位對糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活性及AMPK蛋白表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（10）：2660-2663.

[5]金星林，千昌石，杜希臣，等.改良法建立大鼠原發(fā)性肝癌變模型與病理形態(tài)學(xué)研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（17）：2593-2596.

[6]Lokhande SL，Iyer CM，Shinde RR，et al.A comparative study on the fasting and the postprandial dyslipidaemia in type 2 diabetes mellitus[J].Journal of Clinical&Diagnostic Research，2013，7（4）：627-630.

[7]Zhijun W，Jeffrey W，Patrick C.Treating type 2 diabetes mellitus with traditional chinese and indian medicinal herbs[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，（2013）：7.

[8]程方平，劉松林，李云海，等.溫病濕熱證大鼠模型肝線粒體Na+-K+-ATP酶活力變化的對比研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32（2）：174-175.

[9]孫衛(wèi)，鄭學(xué)芝，李麗，等.葛根素對糖尿病大鼠胰腺線粒體氧化應(yīng)激及 ATP 酶的影響[J].臨床合理用藥，2011，4（8c）：13-14.

[10]Kumar R.Biochemical changes in erythrocyte membrane in type 2 diabetes mellitus[J].Indian J Med Sci，2012，66（5&6）：131-135.

[11]Huang S，Millar AH.Succinate dehydrogenase：the complex roles of a simple enzyme[J].Curr Opin Plant Biol，2013，16（3）：344-349.

[12]胡建鵬，韓小祥，王鍵，等.3種中藥復(fù)方對腦缺血再灌注大鼠腦能量代謝相關(guān)酶影響的比較研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（3）：231-233.

[13]黃麗萍，周蓉，蒙曉芳，等.寒性中藥黃芩對大鼠能量代謝的影響[J].中藥材，2010，33（4）：575-577.

[14]Zakharchenko MV，Zakharchenko AV，Khunderyakova NV，et al.Burst of succinate dehydrogenase and α-ketoglutarate dehydrogenase activity in concert with the expression of genes coding for respiratory chain proteins underlies short-term beneficial physiological stress in mitochondria[J].Int J Biochem Cell Biol，2013，45（1）：190-200.

[15]Piasecka M，Wenda-Rózewicka L，Ogoński T.Computerized analysis of cytochemical reactions for dehydrogenases and oxygraphic studies as methods to evaluate the function of the mitochondrial sheath in rat spermatozoa[J].Andrologia，2001，33（1）：1-12.

[16]Ceylan-Isik AF，F(xiàn)liethman RM，Wold LE，et al.Herbal and traditional Chinese medicine for the treatment of cardiovascular complications in diabetes mellitus[J].Current Diabetes Reviews，2008，4（4）：320-328.