蔣曦媛 陸玉鳳 劉麗艷 余江毅

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇昆山 215300；2.江蘇省中醫(yī)院 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇南京 210029

米格列奈于1992年由Sato等首次合成，是繼瑞格列奈和那格列奈后的第3個(gè)新型苯甲酸衍生物類降糖藥[1]。其不僅具有速效、強(qiáng)效、短效降糖的特點(diǎn)，同時(shí)還有改善胰島素抵抗、抗炎及抗氧化應(yīng)激等作用[2－3]。有研究表明，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與血管內(nèi)皮功能紊亂關(guān)系密切[4]。本研究通過觀察米格列奈對(duì)高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）合成及氧化應(yīng)激的影響，從而進(jìn)一步探討米格列奈對(duì)高糖環(huán)境下人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HAEC及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自于美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室（ScienCell 6100）。胎牛血清購自于杭州四季青生物工程材料研究所。人NO、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA檢測試劑盒購自于美國R and D公司。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對(duì)照組（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、高糖組（葡萄糖濃度為30 mmol/L）、米格列奈組（30 mmol/L葡萄糖濃度+10 μmol/L米格列奈）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HAEC在含10%胎牛血清的培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，條件為：5%CO237℃。在HAECs達(dá)80%左右融合時(shí)用含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化成為成熟HAEC。

1.2.3 一氧化氮及一氧化氮合酶測定 按說明書制成濃度分為 12.5、25、50、100、200 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)液50 μL；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔內(nèi)先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30 min。棄液甩干后每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。輕輕晃動(dòng)搖勻，37℃溫育30 min。再次棄液甩干，加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品濃度。

1.2.4 超氧化物歧化酶的檢測 取細(xì)胞培養(yǎng)液，3500 r/min離心10min，取上清0.1 mL待測。按照說明書要求加入0.1 mL試劑1搖動(dòng)幾下試管，再加入試劑2、3、4各0.1 mL，混勻，塑料薄膜封口，刺一小孔，37℃水浴40 min，加入顯色劑1 mL，混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值，根據(jù)公式計(jì)算SOD活力。

1.2.5 丙二醛的檢測 取培養(yǎng)液，3500 r/min離心10 min，取上清0.05 mL待測。按照說明書要求加入0.05 mL試劑1搖動(dòng)幾下試管，再加入0.75 mL試劑2及0.25 mL試劑3，混勻，塑料薄膜封口，刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻。再次3500 r/min離心10 min，取上清液，532 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值，根據(jù)公式計(jì)算上清液中MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 one－way ANOVA 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用S-N-K檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)HAECs不同時(shí)間NO的變化

以濃度為5.5 mmol/L及30 mmol/L的葡萄糖、30 mmol/L的葡萄糖+10 μmol/L的米格列奈干預(yù)HAECs，收集培養(yǎng)24、48、72 h的細(xì)胞上清液，ELISA法測定NO的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組24 h NO檢測值增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），之后隨著時(shí)間延長，NO含量明顯減少（P＜0.05）。與高糖組相比，米格列奈組24 h NO含量降低，之后增高，48 h及72 h NO含量較高糖組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表1 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組高糖組米格列奈組245.64±3.53 289.76±4.50a 232.71±8.78ab 244.40±4.53 228.04±5.53a 263.48±6.32ab 240.19±7.47 219.25±4.91a 270.91±6.03ab

2.2 藥物干預(yù)HAEC不同時(shí)間細(xì)胞上清液eNOS含量的變化

收集培養(yǎng)24、48、72 h的上清液，ELISA法測定eNOS的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組eNOS含量持續(xù)降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高糖組相比，米格列奈組在各時(shí)間點(diǎn)eNOS含量均顯著性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈細(xì)胞培養(yǎng)上清液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表2 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈細(xì)胞培養(yǎng)上清液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組高糖組米格列奈組49.13±3.21 46.27±3.91a 51.96±2.65ab 44.73±3.15 41.06±3.04a 59.28±3.63ab 45.63±4.05 39.73±3.27a 60.41±4.48ab

2.3 藥物干預(yù)HAEC不同時(shí)間細(xì)胞上清液iNOS含量的變化

收集培養(yǎng)24、48及72 h的上清液，ELISA法測定iNOS的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組iNOS含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中以24 h增高最明顯。與高糖組相比，米格列奈組iNOS含量在各時(shí)間點(diǎn)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

表3 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶含量的影響（μmol/L，±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組高糖組米格列奈組63.89±3.20 79.81±3.21a 53.28±3.45ab 65.47±4.25 69.36±4.27a 62.09±3.71ab 63.13±5.13 66.87±4.28a 59.90±3.60ab

2.4 藥物干預(yù)HAEC不同時(shí)間上清液中SOD活力的變化

分組干預(yù) HAEC，收集培養(yǎng) 6、12、24、48、72 h 的上清液，比色法測定SOD的活力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組SOD活力顯著性下降（P＜0.05）；而與高糖組相比，米格列奈組SOD活力顯著增高（P＜0.05）。見表4。

2.5 藥物干預(yù)HAEC不同時(shí)間上清液MDA含量的變化

分組干預(yù) HAEC，收集培養(yǎng) 6、12、24、48、72 h 的上清液，比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組MDA含量顯著性增高（P＜0.05）；與高糖組相比，米格列奈組MDA含量顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表4 干預(yù)不同時(shí)間超氧化物岐化酶活力的變化（U/mL，±s，n=5）

表4 干預(yù)不同時(shí)間超氧化物岐化酶活力的變化（U/mL，±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組高糖組米格列奈組2.88±0.54 2.03±0.49a 3.99±0.46ab 3.58±0.22 2.32±0.11a 5.70±0.14ab 2.44±0.21 1.58±0.09a 4.98±0.37ab 3.69±0.31 1.03±0.11a 3.18±0.25b 3.90±0.22 2.34±0.19a 3.35±0.51b

表5 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清中丙二醛含量的影響（nmol/mL，±s，n=5）

表5 米格列奈對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清中丙二醛含量的影響（nmol/mL，±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組高糖組米格列奈組0.606±0.017 0.753±0.012a 0.500±0.014ab 0.508±0.021 0.666±0.015a 0.633±0.018ab 0.466±0.017 0.666±0.053ac 0.623±0.051ab 0.403±0.015 0.596±0.023a 0.510±0.030ab 0.400±0.013 0.583±0.017a 0.513±0.015ab

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）位于血流和組織之間，為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞，研究表明它不僅起屏障作用，還具有重要的內(nèi)分泌功能，參與血管損傷的修復(fù)和免疫反應(yīng)[5]，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和血管內(nèi)皮功能的紊亂密切相關(guān)[6]。NO是內(nèi)皮細(xì)胞分泌最強(qiáng)的血管舒張因子，NOS是其合成的限速酶，靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)eNOS，催化生成低濃度的NO，用以舒張血管和抑制血小板聚集。當(dāng)受到外來損傷如高糖刺激時(shí)，iNOS被激活，誘導(dǎo)高濃度的NO的合成，引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡[7]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。以往研究證實(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)與糖尿病血管并發(fā)癥及動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切[8－9]。SOD能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA則是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代表產(chǎn)物之一，可以間接反映細(xì)胞損傷的程度。

本研究觀察到，米格列奈組24 h NO的含量相對(duì)于高糖組是減少的，48、72 h NO的合成及釋放均較高糖組高。同時(shí)米格列奈組iNOS的含量各時(shí)間點(diǎn)均是減少的，說明米格列奈有效抑制了高糖對(duì)iNOS的激活，有利于減少早期iNOS激活后NO大量合成對(duì)細(xì)胞造成的傷害。而米格列奈組eNOS的含量均較高糖組增高。eNOS的激活有利于低濃度NO合成的增加，有利于糾正高糖刺激后內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂。同時(shí)本研究觀察到，高糖組SOD含量較對(duì)照組明顯下降，而MDA含量顯著增高，提示高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活，與以往結(jié)果一致。而與高糖組相比，米格列奈組的SOD活性增高，MDA的含量明顯降低，提示米格列奈對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定的抑制作用，從而對(duì)維護(hù)正常的內(nèi)皮細(xì)胞功能起到有益作用。有研究認(rèn)為高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過激活TGF－β1/PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的iNOS[10]。同時(shí)氧化應(yīng)激可使eNOS表達(dá)下降，減少NO生成，且超氧陰離子可與NO生成過硝酸根離子（OONO－），使NO失活。米格列奈對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制，有利于減少早期高糖刺激的iNOS產(chǎn)生，適度增強(qiáng)eNOS表達(dá)，有利于糾正高糖損傷造成內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

米格列奈作為新型的格列奈類降糖藥，多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已表明其能有效降低血糖，改善糖化血紅蛋白，減少低血糖事件[11]，同樣也顯示了其在改善血脂代謝及降低炎癥因子、延緩動(dòng)脈粥樣硬化等方面的優(yōu)勢(shì)。報(bào)道證實(shí)米格列奈所結(jié)合的磺脲類受體于人的大動(dòng)脈（冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈等）均存在[12]，本研究觀察到其可減少高糖環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的生成，增強(qiáng)eNOS的活性，從而適度促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生，同時(shí)能減輕高糖引起的氧化應(yīng)激損傷，這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步研究。

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