潘 鈺，李金娜，陳思學(xué)，李海英

（黑龍江大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080）

0 引言

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭遇各種不利環(huán)境因子，如高溫、低溫、干旱和高鹽等。植物感受這些脅迫信號(hào)后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來(lái)適應(yīng)不利環(huán)境。因此，尋找抗脅迫相關(guān)蛋白（或基因）對(duì)了解植物抗脅迫機(jī)制以及提高植物抗脅迫性能有著十分重要的意義［1－3］。土地鹽堿化是當(dāng)今世界普遍關(guān)注的問(wèn)題之一，鹽脅迫是限制植物生長(zhǎng)、降低植物產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一［4－6］。

植物在受到鹽脅迫時(shí)會(huì)形成一些蛋白質(zhì)或使某些蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，稱為鹽脅迫蛋白，膜蛋白質(zhì)組是指在特定條件和特定時(shí)間細(xì)胞中的全部膜蛋白［7］。鹽脅迫作用于植物往往是直接使生物膜受到傷害，膜結(jié)構(gòu)完整性及膜功能受到破壞，細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物鹽害的主要部位，其結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞或損傷，進(jìn)而引起一系列生理生化功能的改變，因此深入揭示膜蛋白在響應(yīng)高鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用是非常重要的［8］。

甜菜M14 品系是在栽培甜菜（BetavulgarisL.）染色體基礎(chǔ)上附加野生白花甜菜（B.corollifloraZoss.）第9號(hào)染色體的單體附加系，具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如抗逆、無(wú)融合生殖等，同時(shí)克服了野生白花甜菜復(fù)雜的遺傳背景，并且甜菜是典型的鹽生植物，因此它是挖掘野生白花甜菜耐鹽基因及蛋白的良好材料［9－12］。植物抗逆性的研究一直是生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。膜蛋白的功能決定了膜的功能，膜蛋白在不同細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但由于溶解、分離和鑒定的困難性，各種膜蛋白研究方法很難完全解決膜蛋白研究所面臨的問(wèn)題［13］。獲得鹽脅迫下甜菜M14品系差異表達(dá)膜蛋白，不僅可以研究膜蛋白在響應(yīng)高鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用，還能推動(dòng)甜菜抗逆性的研究，而且可廣泛應(yīng)用于其它農(nóng)作物以提高其抗逆性，從而為培育出更優(yōu)良的作物品種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，這對(duì)改良松嫩鹽堿地、擴(kuò)大甜菜在東北地區(qū)的種植面積具有重要意義。

本研究以甜菜M14品系為試驗(yàn)材料，利用水培法種植甜菜，以不進(jìn)行鹽脅迫的甜菜為對(duì)照，分別以不同濃度氯化鈉進(jìn)行鹽脅迫處理。提取甜菜葉片及根膜蛋白，進(jìn)行定量并采用Western Blot進(jìn)行膜蛋白的檢驗(yàn)，為后續(xù)利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)研究甜菜M14品系鹽脅迫下差異表達(dá)膜蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甜菜M14 品系（Chromosome 9 monosomic addition line ofBetacorollifloraZoss.inBetavulgarisL.，VV＋C9，2n＝18＋1），其染色體組成中除了包含18條栽培甜菜染色體外，還附加有白花甜菜第9號(hào)染色體，種植于黑龍江大學(xué)植物園。

1.2 植物材料的種植和NaCl處理

甜菜M14品系的種子經(jīng)乙醇、升汞和福美雙消毒后，播種在蛭石中，保持蛭石濕潤(rùn)。7d 后，將甜菜M14品系幼苗移至含有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培槽中，在光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25℃／20℃day／night，光照強(qiáng)度450μMol／（m2·s），相對(duì)濕度70%，光周期13h／11hlight／dark。播種21d后，將甜菜M14品系幼苗分成3組，分別用含有0（對(duì)照）、200、400 mMol／L NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液對(duì)甜菜M14品系幼苗進(jìn)行鹽處理，每個(gè)處理組3次重復(fù)。鹽脅迫7d后，甜菜M14品系對(duì)照組和鹽處理組的葉片和根樣品經(jīng)過(guò)液氮速凍后，存放于－80℃冰箱。

1.3 膜蛋白的分離

膜蛋白的提取采用Pang［14］的方法稍作改動(dòng)，將甜菜M14品系對(duì)照組和鹽處理組的葉片及根約10g分別放入液氮預(yù)冷的研缽中，用研棒在液氮中快速磨成粉末，加入適量液氮，反復(fù)研磨，至葉片完全變成白色的細(xì)微粉末即可；將粉末用3倍體積預(yù)冷的勻漿液（2mMol／L EDTA，50mMol／L Tris，pH8.0，250 mMol／L 蔗糖，2 mMol／L DTT，0.2 mMol／L PMSF，0.6%聚乙烯比咯烷酮）溶解，轉(zhuǎn)移至50mL的離心管中，充分勻漿；4℃，8 000g 離心15 min，取上清，重復(fù)2 次；取上清，4℃，100 000g 離心，棄上清；用100 mMol／L預(yù)冷碳酸鈉重懸浮沉淀，用玻璃勻漿器徹底勻漿，冰上保持20min；4℃，100 000g離心，棄上清；用半濃度勻漿液重懸浮沉淀，玻璃勻漿器勻漿，4℃，100 000 g 離心；沉淀重懸浮于50mMol／L Tris中，玻璃勻漿器勻漿，分裝后存于－20℃。

1.4 蛋白質(zhì)定量

使用GE 公司的2D－Quant試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，步驟如下：首先制備工作比色劑，即將100∶1的比色劑A 與比色劑B 相混合，每次測(cè)定時(shí)需要1 mL 工作比色劑；使用2 mg／mL 濃度的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～50μg）；制備含1～50μL待測(cè)樣品的微型離心管，每個(gè)微型離心管（包括含BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的離心管）加入500μL沉淀劑，振蕩并在室溫下培育2～3 min；加入500μL共沉淀劑，短暫混勻，離心（至少10 000g離心力）5 min；棄去上清液，簡(jiǎn)單離心，將殘余的上清液收集至管底，用移液器吸去殘余的上清液；每個(gè)管中加入100μL銅溶液和400μL蒸餾水（應(yīng)徹底震蕩混勻，確保沉淀完全溶解），然后每個(gè)管中加入1mL工作比色劑，應(yīng)確保以最快的速度加入，使之與樣本立即混合，室溫下靜置15～20min；采用分光光度計(jì)測(cè)定樣本和標(biāo)準(zhǔn)溶液的480nm 波長(zhǎng)的吸光率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白質(zhì)含量的吸光率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到樣本蛋白質(zhì)濃度。

1.5 蛋白質(zhì)樣品的Western Blot檢驗(yàn)

蛋白質(zhì)經(jīng)定量之后，取10 μg 的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE；將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中10min；剪切1 張與凝膠大小一致的PVDF膜于甲醇中浸泡2min；將膜與6張與膜同大小的Whatman（3mm）濾紙浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中20min；組裝轉(zhuǎn)移裝置：陽(yáng)極－海綿－3張3 mm 濾紙－PVDF膜－凝膠－3張3mm 濾紙－海綿－陰極，排除氣泡之后封閉轉(zhuǎn)移裝置，146 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2.5h；將轉(zhuǎn)好的膜用PBST 洗3 次后，放于封閉液（TBST＋5%脫脂奶粉）中，4℃封閉過(guò)夜；將封閉好的膜與稀釋后的一抗（陽(yáng)性：Aquaporins，1∶1 000，對(duì)照：RbcL，1∶5 000）室溫雜交90min后，用TBST 室溫洗膜3次，每次10min；將膜與稀釋后的二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000）室溫雜交1h 后，用TBST 室溫洗膜4 次，每次10min；用TBS洗膜2 次，每次8 min；用DAB顯色試劑盒避光處顯色20 min，用去離子水洗膜數(shù)分鐘以終止顯色反應(yīng)，拍照。每次跑2個(gè)重復(fù)樣品，一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，一塊膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜雜交。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下甜菜M14品系膜蛋白質(zhì)的定量分析

按照GE 公司的2D－Quant試劑盒的步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品濃度和吸光度繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)蛋白樣品的OD 值，可得出甜菜M14 品系對(duì)照組葉片蛋白濃度分別為1.036、0.595、0.798μg／μL，甜菜M14品系200 mMol／L NaCl處理葉片蛋白濃度分別為2.293 6、1.659 6、1.729 8μg／μL，400mMol／L NaCl處理葉片蛋白濃度分別為1.155 3、1.059 6、1.489 4 μg／μL，處理甜菜M14品系對(duì)照組根蛋白濃度分別為0.761 4、0.715 9、0.545 5 μg／μL，甜 菜M14品系200mMol／L NaCl鹽處理根蛋白濃度分別為1.056 8、1、1.171 2μg／μL。400 mMol／L NaCl處理根蛋白濃度分別為0.956 4、0.568 2、0.853 8μg／μL。

2.2 鹽脅迫下甜菜M14品系膜蛋白質(zhì)的Western Blot檢驗(yàn)

以甜菜M14品系葉片可溶性蛋白為對(duì)照，將不同鹽濃度處理甜菜M14品系膜蛋白等量上樣進(jìn)行Western Blot雜交，Aquaporins抗體為質(zhì)膜水通道蛋白，為膜蛋白陽(yáng)性抗體；RbcL 抗體為Rubisco大亞基，為葉片中含量最多的可溶性蛋白，因此可以作為膜蛋白提取純度的檢驗(yàn)。葉片及根膜蛋白SDS－PAGE 凝膠考馬斯亮藍(lán)染色圖譜見(jiàn)圖2，Western Blot鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 蛋白質(zhì)SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠圖譜Fig.2 Coomassie Brilliant blue gel map of protein SDS－PAGE

由圖2和圖3 可見(jiàn)，RbcL 理論分子量為55kDa，在SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)染色凝膠圖譜中及Western Blot印跡結(jié)果中均能看到此條帶，說(shuō)明葉片可溶性蛋白與膜蛋白提取物中均存在Rubisco大亞基蛋白，且可溶性蛋白中此蛋白含量最高，在提取膜蛋白過(guò)程中，通過(guò)用碳酸鈉反復(fù)勻漿可減少膜蛋白中可溶性蛋白的含量，但是要將可溶性蛋白完全除去，目前還比較困難。Aquaporins為水通道蛋白，分為很多種，有PIP1；1，PIP1；2，PIP1；3，其理論分子量為28kDa，由葉片和根的膜蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果可見(jiàn)，可溶性蛋白都沒(méi)有得到雜交條帶，主要是因?yàn)榭扇苄缘鞍字胁](méi)有大量富集膜蛋白，膜蛋白含量極少，不能被檢測(cè)到；而不同鹽濃度處理的甜菜M14品系葉片和根的膜蛋白均出現(xiàn)陽(yáng)性雜交結(jié)果，說(shuō)明提取的膜蛋白濃度較高。根中不存在葉綠體，因此沒(méi)有Rubisco大亞基蛋白，不能進(jìn)行此蛋白的Western Blot檢驗(yàn)。

總之，甜菜M14品系葉片及根的膜蛋白提取較為成功，膜蛋白濃度較高，但是純度不能達(dá)到100%，存在可溶性蛋白污染，可進(jìn)行同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)研究。

圖3 膜蛋白Western Blot鑒定Fig.3 Western Blotting of membrane protein

3 討論

3.1 甜菜M14品系膜蛋白的分離

由于膜蛋白的疏水性以及在植物組織中的含量相對(duì)較少，提取有著很大的困難，本試驗(yàn)采取超速離心的方法提取甜菜M14品系膜蛋白，獲得的為微粒體膜蛋白，其中包含質(zhì)膜及各個(gè)細(xì)胞器（主要為葉綠體、線粒體、液泡）的膜蛋白，提取膜蛋白所用勻漿液中加入聚乙烯比咯烷酮，可有效去除酚類物質(zhì)；而PMSF 是一種蛋白酶抑制劑，可防止蛋白質(zhì)降解。

3.2 甜菜M14品系膜蛋白的Western Blot檢驗(yàn)

Western Blot是目前檢驗(yàn)?zāi)さ鞍椎谋容^可行的辦法，本試驗(yàn)所用Aquaporins抗體來(lái)源于蘿卜，RbcL抗體來(lái)源于擬南芥，均非來(lái)源于本試驗(yàn)材料甜菜，說(shuō)明異源抗體也能起到相應(yīng)作用。其中Aquaporins抗體Western Blot鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量較小的部位也有雜交結(jié)果，可能是由于本試驗(yàn)提取的為微粒體膜蛋白包含多種類似的水通道蛋白，因此均能與抗體結(jié)合出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

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