薛 瑞，王明仲，洪學(xué)軍，吳 倩，廉 果，何 標(biāo)

原花青素(Proanthocyanidin/Procyanidin，PC)是天然植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱，是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，為多酚類黃酮。近年研究顯示，PC不僅可以抑制肺癌、慢性骨髓白血病、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長，還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［1-2］。本研究旨在探討PC對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，為研究開發(fā)PC作為抗乳腺癌新藥提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司);順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);MTT和胰蛋白酶(Sigma公司);Caspase-9、Caspase-12酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(GDB公司);ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司);CO2孵箱(JOUAN公司);流式細(xì)胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司);計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件CELLQUEST(B.D.公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定PC對MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用 常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，處于對數(shù)生長期時，常規(guī)消化、洗滌后，以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于5%CO2、37℃孵箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的PC，使最終每組含 PC 濃度分別為 10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個濃度6個復(fù)孔，并設(shè)陽性對照藥順鉑組和正常細(xì)胞組，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h 3個時相進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn):每次于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后按常規(guī)采用酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計算細(xì)胞抑制率，以劑量和生長抑制率做直線相關(guān)分析。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞周期和凋亡將MCF-7細(xì)胞以1×106/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后隨機(jī)分組，分別加入不同濃度的PC，使最終每組含PC 濃度分別為40、80、160 μg/mL，并設(shè)陽性對照藥順鉑組和正常對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置-20℃環(huán)境待測相關(guān)基因蛋白;常規(guī)消化洗滌細(xì)胞后，用70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，置4℃環(huán)境待測凋亡率和細(xì)胞周期。檢測前，先離心棄乙醇，再用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL左右，按照試劑盒說明書操作，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率并分析細(xì)胞周期。

1.2.3 ELISA法檢測凋亡相關(guān)基因蛋白Caspase-9、Caspase-12含量 采用ELISA法檢測凋亡相關(guān)基因蛋白 Caspase-9和 Caspase-12含量。取“1.2.2”項(xiàng)中凍存的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按Caspase-9酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀(波長450 nm)測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算Caspase-9含量。同法檢測Caspase-12的含量。

2 結(jié)果

2.1 PC對MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用 置顯微鏡下觀察，PC作用后的細(xì)胞排列稀疏，隨作用時間延長和藥物濃度的增加細(xì)胞密度逐漸減少。各劑量組PC對MCF-7細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，抑制率與藥物濃度和作用時間呈正相關(guān)。結(jié)果見圖1。

圖1 PC對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 PC對 MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 40、80、160 μg/mL PC作用于MCF-7細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，并出現(xiàn)凋亡典型性特征峰。見表1。

表1 PC對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響(，n=3)

表1 PC對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響(，n=3)

注:與細(xì)胞對照組比較，*P＜0.001

組別 劑量(μg/mL) 凋亡率(%)細(xì)胞對照7.57±0.37順鉑 40 22.49±0.28*PC 40 22.37±0.31*PC 80 31.25±0.38*PC 160 53.42±0.42-*

2.3 PC對MCF-7細(xì)胞周期的影響 PC作用48 h后，細(xì)胞周期均受到不同程度的影響，與對照組相比，3個劑量組G2-M期細(xì)胞比例均顯著增加(P＜0.01);且隨著藥物劑量的增加，G2-M期的比例也增加;G0-G1期和S期略有減少，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示PC可通過G2-M期阻滯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，見表2。

表2 PC對MCF-7細(xì)胞周期的作用(，n=3)

表2 PC對MCF-7細(xì)胞周期的作用(，n=3)

注:與細(xì)胞對照組比較，*P＜0.01，＊＊P＜0.001

細(xì)胞對照- 55.19±0.41 23.00±0.58 21.81±0.36順鉑 40 59.02±1.21*26.69±1.35*14.29±0.92＊＊PC 40 54.10±0.87 21.11±1.98 24.79±1.27*PC 80 52.54±0.91 21.93±2.91 25.53±1.41*PC 160 52.94±1.42 20.32±2.11 26.74±1.75*

2.4 對Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響PC 3個劑量組Caspase-12蛋白表達(dá)均高于對照組(P ＜0.05 或 0.01);在 40、80 μg/mL 劑量下，PC亦促進(jìn)Caspase-9蛋白表達(dá)(P＜0.01)，見表3。

表3 PC對MCF-7細(xì)胞Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害婦女健康。乳腺癌具有易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特性，部分患者在確診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。原花青素作為一種天然藥物，水溶性好，極易被機(jī)體吸收，生物利用度高達(dá)90%以上，具有廣泛的藥理作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤作用較強(qiáng)，可選擇性抑制各種腫瘤細(xì)胞的生長，但對正常組織和細(xì)胞無殺傷作用，在抗腫瘤治療方面有巨大潛力［4］。

細(xì)胞凋亡不僅直接影響機(jī)體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，在腫瘤治療中的作用也已受到極大的重視［5-6］。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑，以前者為主［7-8］。而根據(jù)通路中的起始Caspase蛋白不同，Caspase依賴途徑又可分為3種:①死亡受體通路，激活的Caspase-8可激活下游效應(yīng)Caspase裂解多種蛋白質(zhì)而最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子失衡或者蛋白過量表達(dá)都會誘導(dǎo)產(chǎn)生Caspase-12，同時也導(dǎo)致胞質(zhì)的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，Caspase-7激活 Caspase-12，激活的Caspase-12可進(jìn)一步剪切Caspase-3而引發(fā)細(xì)胞凋亡;③線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，線粒體中的促凋亡蛋白受到凋亡信號刺激，釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase-9及下游的Caspase-3、7或6，其最終都能激活凋亡執(zhí)行者Caspase-3，水解細(xì)胞成分而使細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)分別采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)探討PC對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PC能夠有效殺傷乳腺癌MCF-7細(xì)胞，抑制其增殖，細(xì)胞抑制率呈濃度、時間依賴性，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。PC能夠明顯將細(xì)胞周期阻滯在G2-M期，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其在誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的同時，基因蛋白Caspase-12表達(dá)顯著增加，中、低濃度時也可誘導(dǎo)Caspase-9表達(dá)增加，提示PC抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用機(jī)制與阻滯細(xì)胞周期于G2-M期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，該細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑與Caspase有關(guān)，可能涉及Caspase家族的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體2條激活通路。細(xì)胞凋亡激活信號通路十分復(fù)雜，不同信號分子之間相互聯(lián)系［9］，有待進(jìn)一步研究。

［1］Mitsunaga T.Anti-caries activity of bark proanthocyanidins［J］.Basic Life Sci，1999，66:555-573.

［2］Vayalil PK，Mittal A，Katiyar SK.Proanthocyanidins from grape seeds inhibit expression of matrix metalloproteinases in human prostate carcinoma cells，which is associated with the inhibition of activation of MAPK and NF kappa B［J］.Carcinogenesis，2004，25(6):987-995.

［3］Smart DJ，Halicka HD，Traganos F，et al.Ciprofloxacin induced G2 arrest and apoptosis in TK6 lymphoblastoid cells is not dependent on DNA double-strand break formation［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(1):113-119.

［4］Wu L，Huang Z，Qin P，et al.Chemical characterization of a procyanidin-rich extract from sorghum bran and its effect on oxidative stress and tumor inhibition in vivo［J］.Agric Food Chem，2011，59，8609-8615.

［5］王炎，李琦，范忠澤，等.丹參酮ⅡA介導(dǎo)p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡［J］.世界華人消化雜志，2009，17:124-129.

［6］Lee SK，Kim HN，Kang YR，et al.Obovatol inhibits colorectal cancer growth by inhibiting tumor cell proliferation and inducing apoptosis［J］.Bioorg Med Chem，2008，16:8397-8402.

［7］Vaidya S，Velázquez-Delgado EM，Abbruzzese G，et al.Substrate-induced conformational changes occur in all cleaved forms of caspase-6［J］.J Mol Biol，2011，406(1):75-91.

［8］Reuter S，Eifes S，Dicato M，et al.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochemical Pharmacology，2008，76:1340-1351.

［9］楊潔，鄧子鯤，朱彤陽，等.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體臨床治療應(yīng)用前景［J］.世界臨床藥物，2012，33(2):105-115.