朱廷準(zhǔn)，徐英輝，李曉明，羅力涵，梁國標(biāo)*

腦膠質(zhì)瘤是人類神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點［1］。目前國內(nèi)外尚無理想的治療方法，常用的化療藥物療效較差。欖香烯(Elemene)是從中藥莪術(shù)中提取的非細(xì)胞毒性藥物，目前已應(yīng)用于肺癌、膀胱癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療［2-3］。前期的多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯可以顯著抑制患者體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長，延長生存期，且未出現(xiàn)明顯的毒副作用［4-5］。但是由于其抗膠質(zhì)瘤的分子機制不明，限制了在臨床上的應(yīng)用。本實驗通過觀察欖香烯對人U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制及細(xì)胞周期阻滯作用，結(jié)合MEK信號通路中的MKK3和MKK6分子在其中的關(guān)鍵性作用，初步闡述了欖香烯抗膠質(zhì)瘤作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。欖香烯由大連金港制藥有限公司生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國 GIBCO公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。MTT試劑、碘化丙啶(PI)購自德國 Sigma公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。磷酸化蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。DN-MKK3質(zhì)粒、DN-MKK6質(zhì)粒由加拿大多倫多大學(xué) Jim Woodgett教授惠贈?？筂KK3抗體購自美國Santa公司，抗p-MKK3、MKK6和p-MKK6抗體購自英國Abcam公司。辣根酶標(biāo)記的羊抗兔及兔抗小鼠抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素 50 IU/mL，鏈霉素 50 mg/mL)中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(MTT法) 將對數(shù)生長期的U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞以6×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中(每組設(shè)5個復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h，分別加入 0、20、40、60、80 μg/mL 濃度的欖香烯，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育0、12、24、36、48 h。然后每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS沖2遍后，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 Western blot檢測 ①按實驗需要處理細(xì)胞后，胰酶消化并收獲細(xì)胞，置于冰盒上操作。將細(xì)胞放置于Eppendorf管中。于4℃ 3 000 rpm離心5 min以沉淀細(xì)胞，棄上清。用4℃冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次。用凱基公司的磷酸化蛋白提取試劑盒，按說明書比例配制細(xì)胞裂解液。每EP管中加入200 μL裂解液重懸細(xì)胞沉淀物，吹打。在5×SDS上樣緩沖液中煮細(xì)胞5 min，使蛋白充分變性，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基)對樣品蛋白進行定量檢測。②按濃縮膠6%、分離膠10%的濃度，配制聚丙烯酰胺凝膠。加樣，在150 V電壓下電泳約2.5～3 h，直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)距玻璃板下緣約1 cm時停止電泳。將電泳后的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)到NC膜上。5%脫脂奶粉(TTBS配制)4℃過夜封閉。一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h。ECL檢測，Gel-Pro Analyzer 4.0軟件(Media Cybernetics)分析目的條帶。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)染 將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞以4×105/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體通過瞬時轉(zhuǎn)染方法(步驟詳見Lipofectamine 2000說明書)，將空質(zhì)粒以及HA標(biāo)簽標(biāo)記的DN-MKK3和DNMKK6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入U87MG細(xì)胞中。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的人U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以4×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，欖香烯共同孵育24 h，收集各組細(xì)胞，離心，棄上清，PBS洗2次，加入70%乙醇1 mL，充分混勻，-20℃過夜。檢測前離心，棄上清，PBS洗2次，加0.2 mg/mL Rnase 37℃共同孵育1 h，PI染液置暗處染色30 min，細(xì)網(wǎng)過濾，于流式細(xì)胞儀上進行熒光檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件。每一項分析至少有3次結(jié)果。數(shù)值以表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 欖香烯抑制人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖 分別以 0(對照組)、20、40、60、80 μg/mL(藥物組)濃度的欖香烯處理對數(shù)生長期的人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，然后行MTT法檢測細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，欖香烯能顯著抑制人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性，該抑制作用呈時間和劑量依賴性(圖1A、B)。欖香烯處理后的U87MG細(xì)胞突起收縮、形態(tài)變圓、胞核縮小，部分細(xì)胞松動脫落，并在一定程度上出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象(圖1C～E)。

圖1 欖香烯抑制人U87MG和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與時間和劑量的關(guān)系

2.2 欖香烯增加人U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MKK3和MKK6的磷酸化水平 不同濃度的欖香烯處理U87MG細(xì)胞1 h后行Western blot檢測。結(jié)果顯示，隨著欖香烯濃度的增加，p-MKK3和p-MKK6的表達(dá)水平顯著增高，而MKK3和MKK6的總蛋白的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化(見圖2)。

圖2 欖香烯增加人U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MKK3和MKK6的磷酸化水平

2.3 抑制MKK3和MKK6的活性導(dǎo)致欖香烯的抗膠質(zhì)瘤作用降低 為進一步檢測MKK3/6在欖香烯抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用，將DN-MKK3和DN-MKK6突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入U87MG細(xì)胞中。設(shè)空質(zhì)粒載體組為對照組(圖3，柱a)，其他4組為實驗組(圖3，柱b～e)。采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，在60 μg/mL欖香烯的作用下，DN-MKK3 組(圖3，柱 c)、DN-MKK6 組(圖3，柱d)以及 DN-MKK3+DN-MKK6共轉(zhuǎn)染組(圖3，柱e)的細(xì)胞活性明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(圖3，柱 b，P＜0.05或 P＜0.01)。結(jié)果顯示，阻斷MKK3/6活性可使欖香烯的抗瘤作用顯著減弱，MKK3/6介導(dǎo)欖香烯的抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用。

圖3 抑制MKK3和MKK6活性與欖香烯抗膠質(zhì)瘤增殖作用的關(guān)系

在空質(zhì)粒、DN-MKK3、DN-MKK6和 DNMKK3+DN-MKK6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入U87MG細(xì)胞后，細(xì)胞被60 μg/mL的欖香烯處理24 h，行MTT檢測。與空質(zhì)粒組相比，DN-MKK3組(柱 c)和DN-MKK6組(柱d)中欖香烯抗細(xì)胞增殖作用部分被削弱。而在DN-MKK3+DN-MKK6共轉(zhuǎn)染組(柱e)中，欖香烯的抗瘤作用幾乎被完全抵消。

2.4 抑制MKK3和MKK6的活性導(dǎo)致欖香烯的細(xì)胞周期G0/G1期阻滯作用減弱 本實驗包括5組:欖香烯+空質(zhì)粒組、欖香烯+DN-MKK6組、欖香烯+DN-MKK3組、欖香烯+DN-MKK6+DNMKK3組以及空質(zhì)粒組(圖4 E)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，欖香烯+空質(zhì)粒組中G0/G1期比例較空質(zhì)粒組明顯升高。在欖香烯的作用下，DNMKK3(圖4 C)、DN-MKK6(圖4 B)和DN-MKK3+DN-MKK6共轉(zhuǎn)染組(圖4d)G0/G1期的比例較空質(zhì)粒組(圖4 A)更低(P＜0.05或P＜0.01)，即:抑制MKK3和MKK6的活性可導(dǎo)致U87MG細(xì)胞對欖香烯的抗藥性增加。結(jié)果表明，欖香烯的抗腫瘤作用是通過激活MKK3/6通路，將膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期，進而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖來實現(xiàn)的。

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種最常見、最頑固的顱內(nèi)惡性腫瘤。目前，臨床治療膠質(zhì)瘤主要以手術(shù)、化療或放療為主要治療手段，但效果均不理想。因此，如何提高膠質(zhì)瘤療效，延長患者的生存期，已成為神經(jīng)外科最富挑戰(zhàn)性而又亟待解決的一個難題。

欖香烯是從姜科植物溫郁金(莪術(shù))中提取的以欖香烯為主要成分的混合物。實驗藥理學(xué)研究證實，欖香烯對體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞具有較強的抑制和殺傷效應(yīng)，而且該作用具有一定的特異性。欖香烯不但具有直接抗腫瘤作用，還有免疫保護與放化療協(xié)同作用，能緩解癌性疼痛、升高白細(xì)胞和抑制血小板聚集等。相對于大多數(shù)化療藥物而言，該藥毒副作用小，無明顯肝、腎功能損害，不發(fā)生骨髓抑制［6］。筆者在前期的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，欖香烯對膠質(zhì)瘤具有明顯的抗腫瘤作用。然而，由于欖香烯抗膠質(zhì)瘤作用的分子機制不明，成為其在臨床推廣應(yīng)用的“瓶頸”。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs)是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種過程［7-8］。MAPKs經(jīng)其上游的MAPK激酶激酶(MKKK)和MAPK激酶(MEK)磷酸化而活化，形成“刺激-MKKK-MEK-MAPK-反應(yīng)底物”的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)。MAPKs信號通路主要包括p38 MAPK、JNK和ERK 3條通路［9-11］。MEK中的兩個重要成員MKK3和MKK6是p38 MAPK的上游激酶。國內(nèi)外的多項研究顯示，MKK3/6-p38 MAPK通路在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中起著重要作用。在NIH3T3細(xì)胞中，亞砷酸鈉通過激活p38 MAPK引起短暫的細(xì)胞生長延遲［12］;MKK3/6-p38 MAPK在笑氣和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞凋亡中扮演重要角色［13］。此外，MKK3/6也介導(dǎo)了異黃酮衍生物、丁酸鈉、TNF-α、2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷等多種藥物的抗癌作用［14-15］。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，MKK3/6是p38 MAPK的特異性激活因子，但最近的研究顯示，p38 MAPK可不依賴于“MKKKMKK3/6-p38 MAPK”途徑而被激活。本課題組前期的研究顯示，p38 MAPK的激活和Raf/ERK的抑制介導(dǎo)了欖香烯的抗膠質(zhì)瘤作用［16-19］。因此，MKK3/6是研究欖香烯抗膠質(zhì)瘤機制過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖4 MKK3和MKK6的活性抑制與欖香烯細(xì)胞周期G0/G1期阻滯作用關(guān)系

本實驗顯示，欖香烯可以使U87MG細(xì)胞停滯于G0/G1期，阻止其向DNA復(fù)制加倍的S期及M期轉(zhuǎn)化，從而造成腫瘤細(xì)胞的生長緩慢和增殖活性降低。進一步的研究顯示，MKK3/6信號通路的磷酸化激活在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。相反，通過轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變體質(zhì)粒抑制MKK3和MKK6的活性則可以抵消欖香烯的抗膠質(zhì)瘤作用。因此，MKK3/6激活對欖香烯抗膠質(zhì)瘤增殖的介導(dǎo)作用為欖香烯的臨床應(yīng)用在分子水平上提供了理論依據(jù)，也為膠質(zhì)瘤的分子治療提供了重要的參考靶點。然而，欖香烯是如何調(diào)控MKK3/6信號通路的活性，其上下游還有哪些分子事件發(fā)生，尚有待于更深入的研究。

［1］Fisher PG，Buffler PA.Malignant gliomas in 2005:where to go from here［J］.JAMA，2005，293(5):615-617.

［2］Wang G，Li X，Huang F，et al.Antitumor effect of beta-elemene in non-small-cell lung cancer cells is mediated via induction of cell cycle arrest and apoptotic cell death［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62(7-8):881-893.

［3］Yu Z，Wang R，Xu L，et al.β-Elemene piperazine derivatives induce apoptosis in human leukemia cells through downregulation of c-FLIP and generation of ROS［J］.PLoS One，2011，6(1):e15843.

［4］周洪語，沈建康，侯菊生，等.欖香烯抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究［J］.遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2003，17(4):189-191.

［5］徐英輝，侯菊生，周洪語.頸動脈持續(xù)灌注欖香烯治療老年多發(fā)腦轉(zhuǎn)移癌的臨床探討［J］.中國腫瘤臨床，2005，31(24):1423-1424.

［6］Chen M，Wang S，Tan M，et al.Applications of nanoparticles in herbal medicine:zedoary turmeric oil and its active compound β-elemene［J］.Am J Chin Med，2011，39(6):1093-1102.

［7］Kyriakis JM，Avruch J.Mammalian MAPK signal transduction pathways activated by stress and inflammation:a 10-year update［J］.Physiol Rev，2012，92(2):689-737.

［8］何莉，周煥娟.MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖皮質(zhì)激素耐藥白血病中的研究進展［J］.實用藥物與臨床，2012，15(7):434-436.

［9］Kang YJ，Seit-Nebi A，Davis RJ，et al.Multiple activation mechanisms of p38alpha mitogen-activated protein kinase［J］.J Biol Chem，2006，281(36):26225-26234.

［10］Zhu T，Xu Y，Dong B，et al.β-elemene inhibits proliferation of human glioblastoma cells through the activation of glia maturation factor β and induces sensitization to cisplatin［J］.Oncol Rep，2011，26(2):405-413.

［11］Zhao YS，Zhu TZ，Chen YW，et al.Beta-elemene inhibits Hsp90/Raf-1 molecular complex inducing apoptosis of glioblastoma cells［J］.J Neurooncol，2012，107(2):307-314.

［12］Kim JY，Choi JA，Kim TH，et al.Involvement of p38 mitogenactivated protein kinase in the cell growth inhibition by sodium arsenite［J］.J Cell Physiol，2002，190(1):29-37.

［13］Makeeva N，Myers JW，Welsh N.Role of MKK3 and p38 MAPK in cytokine-induced death of insulin-producing cells［J］.Biochem J，2006，393(Pt 1):129-139.

［14］Chen JT，F(xiàn)ong YC，Li TM，et al.DDTD，an isoflavone derivative，induces cell apoptosis through the reactive oxygen species/apoptosis signal-regulating kinase 1 pathway in human osteosarcoma cells［J］.Eur J Pharmacol，2008，597(1-3):19-26.

［15］Cho SD，Ahn NS，Jung JW，et al.Critical role of the c-JunNH2-terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways on sodium butyrate-induced apoptosis in DU145 human prostate cancer cells［J］.Eur J Cancer Prev，2006，15(1):57-63.

［16］Yao YQ，Ding X，Jia YC，et al.Anti-tumor effect of beta-elemene in glioblastoma cells depends on p38 MAPK activation［J］.Cancer Lett，2008，264(1):127-134.

［17］姚軼群，徐英輝，盧軍，等.p38在欖香烯致鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞周期阻滯中的作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(1):56-58.

［18］趙永順，董斌，吳春明，等.欖香烯阻礙大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞ERK信號通路中Hsp90/Raf-1分子復(fù)合體的形成［J］.實用藥物與臨床，2011，14(4):274-276.

［19］趙永順，吳春明，董斌，等.欖香烯抑制Raf/MEK/ERK信號通路誘導(dǎo)人源膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡［J］.實用藥物與臨床，2011，14(5):365-367.