翟鳳艷,張方鵬,崔明洋,劉英杰

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

蜜環(huán)菌[Armillariella melle a（Vahl.ex Fr.）Karst]是我國一種珍貴的藥食兼用真菌,隸屬于擔子菌門,擔子菌綱,傘菌目,口蘑科,其子實體又稱榛蘑,廣泛分布于溫帶地區(qū)[1].蜜環(huán)菌美味可口,含有人體必需的多種氨基酸、微量元素及維生素[2].經(jīng)常食用可增強機體免疫力,具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗衰老、增強耐缺氧能力等作用[3-4].

國內(nèi)外對蜜環(huán)菌多糖進行的藥理學研究表明,其具有抗輻射、促進造血、抑制腫瘤生長、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[5],因此迄今為止蜜環(huán)菌多糖的提取及生物活性得到了廣泛的研究,但對蜜環(huán)菌其他成分及其功能的研究鮮見詳細報道.本研究從清除DPPH·、清除羥基自由基·OH和清除超氧陰離子自由基·三方面研究了蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索乙醇提取物的體外抗氧化效果及抑菌活性,為蜜環(huán)菌生物活性的深入研究及開發(fā)應用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 蜜環(huán)菌干子實體,購于昆明食用菌研究所；蜜環(huán)菌菌種,購于吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所；供試菌種為4種細菌,分別是金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach,產(chǎn)氣桿菌Bacillas perfringens Veillon et Zuber,變形桿菌 Bacterium proteus Weil et Felix,枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn,用以測定蜜環(huán)菌提取液抑菌活性.供試菌種由河南科技學院資源與環(huán)境學院植物病理實驗室提供.

1.1.2 試劑與儀器 DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）為美國Sigma公司產(chǎn)品,鄰苯三酚、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2、無水乙醇、鹽酸等,均為國產(chǎn)分析純.TU-1 201紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 蜜環(huán)菌提取物的制備

子實體提取物制備：將蜜環(huán)菌子實體在40℃烘箱中烘干至恒重,粉碎,稱取100 g干粉,加入200 mL體積分數(shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過濾,收集濾液.用相同方法重復提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用體積分數(shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,定容至100 mL,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的子實體提取液,于磨口瓶中儲存?zhèn)溆?

液體發(fā)酵菌絲體提取物制備：將蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基于25℃條件下活化,無菌條件下將幼嫩菌索接種入裝有150 mL PD培養(yǎng)液的錐形瓶中,置于25℃的恒溫搖床中,120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2周,過濾得液體發(fā)酵菌絲體,置于40℃烘箱中烘干至恒重,得3.5 g干品,用200 mL體積分數(shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過濾,收集濾液.用相同的方法重復提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用3.5 mL體積分數(shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的菌球提取液,于磨口瓶中儲存?zhèn)溆?

菌索提取物制備：將蜜環(huán)菌菌種用PDA培養(yǎng)基于25℃條件下擴繁,剔除培養(yǎng)基,用清水沖洗,收集得蜜環(huán)菌菌索,置于40℃烘箱中烘干至恒重,得7.0 g干品,用200 mL體積分數(shù)為90%的乙醇浸泡24 h,過濾,收集濾液.用相同的方法重復提取3次,合并提取液,置于55℃的恒溫水浴鍋中,直至提取液完全揮發(fā),再用7.0 mL體積分數(shù)為90%的乙醇將剩余提取物重新溶解,得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的菌索提取液,于磨口瓶中儲存?zhèn)溆?

1.2.2 抗氧化活性測定

清除DPPH·活性測定：根據(jù)Astrid von Gadow等的方法[6],分別取質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.2 g/mL的乙醇提取物溶液2 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL,搖勻后,于室溫下在黑暗處反應30 min.以無水乙醇調(diào)零,測定517 nm處的吸光值A樣品.同時,測定2.0 mL乙醇提取物溶液與2.0 mL乙醇混合液在517 nm處的吸光值A空白,再測定2.0 mL DPPH乙醇溶液與2.0 mL乙醇在517 nm處的吸光值A對照.每個濃度重復測定3次,取其吸光度的平均值.用相同的方法測定與乙醇提取物樣品相同濃度的抗壞血酸對DPPH·的清除能力.清除率計算公式為：

清除·OH活性測定：參照陳留勇等修改后的Smirnoff水楊酸法[7-8].反應體系中分別含8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL,9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL和1 mL質(zhì)量濃度梯度為1.0、0.5、0.2 g/mL的乙醇提取物溶液.其中,H2O2最后加入并啟動整個體系,37℃水浴中反應30 min.以蒸餾水作空白對照,每個質(zhì)量濃度重復測定3次,取其吸光度的平均值.用相同的方法測定與乙醇提取物樣品相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對·OH的清除能力.清除率計算公式為：

式中：A本底為樣品溶液的本底吸光值（即加入FeSO4、水楊酸、乙醇提取物溶液,不加H2O2的吸光度值）.

式中：A本底為用水代替鄰苯三酚時不同乙醇提取物質(zhì)量濃度下測得的吸光值.

1.2.3 抑菌活性測定

菌種活化：將保存的細菌菌種在無菌條件下接種于滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

菌懸液的制備：用比濁法[10]制備菌懸液,麥法蘭云度計可作為混濁度的比較標準.取潔凈試管加入質(zhì)量分數(shù)為1%的BaCl2溶液0.1 mL,體積分數(shù)為1%的H2SO4溶液9.9 mL,以此混濁度相當于3×108細菌數(shù),分別制備以上供試菌種的菌懸液.

抑菌試驗：在無菌條件下用移液槍移取1 mL制備好的菌懸液與熔化后的培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中混合均勻.待凝固后取滅過菌的直徑為6 mm的濾紙片,將濾紙片在制備好的質(zhì)量濃度為1 g/mL的蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體和菌索乙醇提取液中充分浸泡后放置培養(yǎng)皿中,每皿3個濾紙片均勻放置.對照組濾紙片用體積分數(shù)為90%的乙醇浸泡.每種病原細菌設置1個對照,3個重復.放置25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后觀察,用十字交叉法測量菌落直徑,以其平均值表示菌落生長直徑,計算抑菌率.

菌落平均直徑/mm=培養(yǎng)皿直徑-抑菌圈平均直徑-濾紙片直徑

抑菌率/%=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性

蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物及相同濃度抗壞血酸抗氧化活性測定結果見表1.

表1 蜜環(huán)菌提取物及抗壞血酸抗氧化活性Fig.1 Antioxidantactivity of Armillariella mellea extracts and Vc

由表1可知,蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索乙醇提取物對3種自由基均具有一定的清除能力,且濃度越高,清除效果越好,但清除能力均低于對照天然抗氧化劑抗壞血酸.3種提取物對DPPH·的清除率最高,對·OH的清除率次之,對·的清除率最低.子實體和液體發(fā)酵菌絲體提取物對DPPH·清除率高于菌索提取物,子實體提取物對·OH清除效果明顯優(yōu)于液體發(fā)酵菌絲體及菌索提取物,液體發(fā)酵菌絲體對·清除能力最差.

2.2 抑菌活性

蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物對4種供試細菌的抑制作用結果見表2.

表2 蜜環(huán)菌提取物抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of Armillariella mellea extracts

由表2可知,在1 g/mL質(zhì)量濃度下,蜜環(huán)菌不同乙醇提取物對4種供試細菌的抑菌效果都不高,且對不同供試細菌作用效果不一致.子實體乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果好于產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌；液體發(fā)酵菌絲體提取物對變形桿菌的抑制效果稍好,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌次之,對產(chǎn)氣桿菌的抑制效果最差；菌索提取物對枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌的抑制作用好于變形桿菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果最差.

3 結論與討論

本試驗采用天然抗氧化劑抗壞血酸作為陽性對照,通過蜜環(huán)菌子實體、液體發(fā)酵菌絲體、菌索乙醇提取物和抗壞血酸幾者之間抗氧化作用的比較,研究了蜜環(huán)菌不同材料乙醇提取物對DPPH·、·OH和3種自由基的清除能力,以及其對4種供試細菌的抑制作用.結果表明,蜜環(huán)菌提取物在質(zhì)量濃度為1 g/mL的條件下,對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌4種供試細菌的抑菌活性都不高,最大抑菌率僅達到15.77%.這可能與提取物濃度偏低有關,在高濃度條件下蜜環(huán)菌提取物對幾種供試細菌及其他病原細菌的抑菌活性有待進一步研究.在不同濃度條件下,蜜環(huán)菌3種醇提物對DPPH·、·OH、和3種自由基都表現(xiàn)出較強的清除能力,且清除效果與濃度呈顯著的正相關,但都低于相同濃度的陽性對照抗壞血酸.3種提取物對DPPH·的清除率最高,對O2-·的清除率最低,另外不同提取物對不同的自由基清除作用存在差異,可能是因為子實體、液體發(fā)酵菌絲體及菌索培養(yǎng)條件差異導致抗氧化活性成分不同.綜上所述,蜜環(huán)菌多糖具有一定的抗氧化能力,可用于制備具有抗氧化活性的天然活性物質(zhì)和開發(fā)蜜環(huán)菌多糖類藥物及功能性食品,但在較高濃度下蜜環(huán)菌提取物的抗氧化活性、抗壞血酸的清除能力差異以及不同材料抗氧化活性物質(zhì)仍需進行深入研究.

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