彭敏燕， 梁旭方， 方 榮， 于海靜， 朱 滔

(暨南大學生命科學技術學院生物工程學系，廣東廣州510632)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)、暖鱸科(Percichthyidae)、鱖屬，俗稱桂魚、桂花魚、胖鱖、季花魚等，是淡水底棲的肉食性魚類.它具有體型大，生長快，味道鮮美等特點，深受國內(nèi)外消費者喜愛，有“淡水石斑魚”之稱.目前，人工養(yǎng)殖的鱖魚主要是翹嘴鱖和大眼鱖，翹嘴鱖養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已經(jīng)成為我國重要的名貴經(jīng)濟魚類，因而具有很大商業(yè)養(yǎng)殖價值［1］.淀粉酶(amylase，AMY)是一種消化酶，主要分布在翹嘴鱖的腸道和胰臟中［2］，它能水解食物中的淀粉形成二糖和三糖，再由其他酶轉(zhuǎn)化成能量以供魚類生長代謝［3］.不過魚類本身分泌的AMY等消化酶還不能夠滿足其快速生長發(fā)育的需要，養(yǎng)殖中需要在飼料中額外添加適量外源酶來彌補內(nèi)源酶的不足，以提高飼料的利用率并促進魚類生長［4］.因此，從分子水平上對AMY基因進行研究，對促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中翹嘴鱖的生長發(fā)育具有重要的意義.

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是廣泛存在于基因組中的一類由單個堿基轉(zhuǎn)換或顛換引起的 DNA序列變異，除了密度高、遺傳穩(wěn)定的特點外，更重要的是某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結構或表達水平［5］.微衛(wèi)星 (microsatellite)又稱簡單序列重復(simplesequencerepeats，SSR)，是指以少數(shù)幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的簡單多次串聯(lián)重復序列，廣泛存在于各類真核基因組中，它具有多態(tài)性高、結果穩(wěn)定可靠等特點.因此，它和SNP標記都是十分理想的分子標記，在遺傳圖譜構建、數(shù)量性狀位點(QTL)定位、標記輔助選擇、遺傳多樣性評估等領域都有著重要的應用價值［6］.例如 Dickey等［7］發(fā)現(xiàn)果蠅AMY調(diào)控基因的多態(tài)性位點影響了果蠅淀粉酶的分泌水平;豬ATF4基因的SNP位點A159G對臀部膘厚有極顯著影響［8］.此外，呂偉華等［9］采用23對微衛(wèi)星分別標記了鯉魚的體長、體高、體厚和體質(zhì)量4種經(jīng)濟性狀;林琳等［10］在中國人群中對妊高癥相關基因eNOS內(nèi)含子13進行了微衛(wèi)星標記.目前，國內(nèi)外有關養(yǎng)殖業(yè)動物AMY基因多態(tài)性位點檢測的報道中，常見的有家畜、貝類、甲殼類以及一些經(jīng)濟魚類等［11－13］，而關于翹嘴鱖AMY基因SNP及微衛(wèi)星多態(tài)性位點檢測的研究則尚未見報道.因此，本研究試圖初步對影響生長發(fā)育有的AMY進行SNP和微衛(wèi)星多態(tài)性位點的檢測，為后期進行翹嘴鱖的分子遺傳育種提供理論依據(jù).實驗首先對翹嘴鱖AMY基因組序列進行DNA測序，初步檢測出SNPs和微衛(wèi)星多態(tài)性位點，并通過CRS-PCR和PCR-DS法對SNPs位點進行驗證和分型，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測微衛(wèi)星多態(tài)性.以期為今后研究翹嘴鱖AMY基因的結構和功能提供分子標記，以及從分子水平上為后期探索AMY基因的多態(tài)性與翹嘴鱖生長發(fā)育的關系奠定其理論基礎，有利于加快翹嘴鱖遺傳選育進程.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗材料 翹嘴鱖購于廣東佛山新榮魚苗繁殖場，全部系人工繁育苗種，其親魚均源自長江水系，實驗用魚共166尾.以鯪魚苗作為餌料魚，大小要適口.

(2)主要試劑 TIANGEN DNA提取試劑盒為合達公司(廣州)產(chǎn)品，TaqTM DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶為寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)產(chǎn)品，其他試劑均為進口分裝或者國產(chǎn)分析純試劑.

(3)引物設計及合成 根據(jù)本實驗室提供的鱖魚AMY基因組序列(GenBank登陸號:EU9028272)，用軟件Primer Premier 5和Primer 1.0綜合分析，設計5對引物(P1-P5)用于翹嘴鱖AMY基因SNPs位點的檢測.引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物信息如表1.

表1 翹嘴鱖AMY基因各引物信息Table 1 Primers information of AMY gene in Siniperca chuatsi s

1.2 方法

(1)基因組DNA提取 獲取實驗魚的鰭條組織，按TIANGEN DNA提取試劑盒推薦方法提取基因組DNA.

(2)PCR擴增和產(chǎn)物純化測序 隨機選取翹嘴鱖DNA模板20個，分別用5對引物(P1－P5)進行PCR擴增，PCR反應體系:10×buffer緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaq 酶 0.125 μL，模板 1 μL，引物各加 0.5 μL，最后補充雙蒸水(ddH2O)至 25 μL.PCR擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，根據(jù)不同引物的退火溫度進行退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃下延伸5 min.PCR產(chǎn)物純化及測序由上海英駿生物技術有限公司完成.

(3)SNPs位點的篩選和分型 應用序列分析軟件Clustal X，DNAStar和Chromas綜合分析測序結果，篩選出AMY基因中的SNP位點，然后采用CRSPCR法對部分SNP位點進行分型［14］.使用在線錯配引物設計軟件 dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)設計錯配引物 P6(見表1)，然后使用引物P6擴增PCR產(chǎn)物，使產(chǎn)物中的SNP位點A1可被TaqI酶切.酶切體系:TaqI 0.5 μL，BSA 1.0 μL，Buffer 1.0 μL，PCR 產(chǎn)物 0.4 μL，最后補充雙蒸水至10 μL.酶切產(chǎn)物使用質(zhì)量分數(shù)12%的聚丙烯酰胺凝膠(VAcr∶VBis=29∶1)進行電泳，120 V電壓電泳4 h后銀染顯色.另外，對不能使用CRS-PCR法的SNPs位點 A2、A3和 A4采用 PCRDS法進行分型.

(4)微衛(wèi)星位點的檢測及分型 使用SSRHunter 1.03搜索鱖魚AMY基因組的微衛(wèi)星序列，并設計特異引物P7(見表1).擴增后的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)12%的聚丙烯酰胺凝膠中用120 V電壓電泳4 h，銀染顯色.

(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計 統(tǒng)計各SNPs和微衛(wèi)星位點的基因型，采用遺傳多樣性分析軟件(PopGene 32)和多態(tài)信息含量計算軟件(PIC-Calc 0.6)計算翹嘴鱖的遺傳多樣性指標.

2 結果與分析

2.1 翹嘴鱖AMY基因SNPs位點的測序及酶切結果

對翹嘴鱖AMY基因P1-P5的PCR產(chǎn)物測序結果進行分析，結果發(fā)現(xiàn)4個SNPs位點.在第1內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)了一個C/G的突變位點A1;在第5內(nèi)含子處發(fā)現(xiàn)了3個 SNPs位點，分別命名為 A2、A3和A4.A2位點發(fā)生了T/A突變，A3發(fā)生了A/T突變，A4發(fā)生了G/C突變.

圖1 翹嘴鱖AMY基因A1、A2、A3和A4 4個SNPs位點的測序峰圖(箭頭表示突變發(fā)生的位置)Fig.1 Sequencing pictures of four SNPs A1，A2，A3 and A4 of AMY gene in Siniperca chuatsi(Arrows show the positions of variation)

圖2 翹嘴鱖AMY基因SNP位點A1酶切電泳圖Fig.2 CRS-PCR picture of SNP locus A1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

采用CRS-PCR方法對A1位點分型，結果共檢測到3種基因型，分別為 GG(205 bp、21 bp)、GC(226 bp、205 bp、21 bp)和 CC(226 bp)，21 bp 的電泳帶太小沒有在電泳圖中顯示出來，A1測序峰圖和酶切圖分別見圖1和圖2.由于A2、A3和A4 3個SNPs位點兩邊的序列不適合設計酶切引物，因此無法采用酶切的方法進行分型，實驗將部分模板使用PCR-DS法分型.測序結果發(fā)現(xiàn)A2位點有兩種基因型，分別為AT和TT;A3位點有3種基因型，分別為AA、AT和TT;A4位點也有3種基因型，分別是AA、AG和GG.這3個SNPs位點的測序結果如圖1.

2.2 翹嘴鱖AMY基因SNPs位點的基因頻率、基因型頻率及遺傳多態(tài)信息分析

統(tǒng)計翹嘴鱖AMY基因4個SNPs位點的基因型和基因頻率，詳見表2.卡方分析表明，4個SNPs位點P值均大于0.05，說明基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡.當PIC＞0.5為高度多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)性，PIC＜0.25為低度多態(tài)性.由表2可知，AMY基因的4個SNPs位點均為中度多態(tài)性.各位點的有效等位基因數(shù)與等位基因的絕對值接近，說明等位基因在兩個群體中的分布均勻;且雜合度為0.345 7－0.492 0，顯示了較好的遺傳多態(tài)性.

表2 翹嘴鱖AMY基因4個SNPs位點的遺傳多態(tài)信息Table 2 Genetic information of four SNPs locus of AMY gene in Siniperca chuatsi

2.3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點B1的分型與遺傳多態(tài)性分析

從翹嘴鱖AMY基因組序列第5內(nèi)含子中檢測到一個重復序列為(TTA)18(TAA)18的微衛(wèi)星座位B1，將該位點通過PCR擴增后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果呈多態(tài)性(如圖3).結合微衛(wèi)星位點B1的測序結果分析發(fā)現(xiàn)有4個等位基因，微衛(wèi)星等位基因大小分別為 96、99、102、105 bp，共組成 9 種單倍型.由表3可知，在翹嘴鱖群體中B1位點的雜合度為0.705 5，且多態(tài)信息含量大于0.5，說明翹嘴鱖兩個群體遺傳多樣性非常豐富，具有高度多態(tài)性.

圖3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點B1的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 PAGE picture of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

表3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點B1在翹嘴鱖群體中的遺傳多態(tài)信息Table 3 Genetic information of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

3 討論

AMY在許多水生動物中控制著碳水化合物的代謝，并且是影響身體生長的主要因素之一［15］，因此本實驗選擇AMY基因作為候選基因進行研究，尋找可能影響翹嘴鱖生長的多態(tài)性位點.實驗結果發(fā)現(xiàn)翹嘴鱖AMY基因具有兩種分子標記，其中包括4個SNPs位點和一個微衛(wèi)星位點.SNPs位點中除了A2只有兩種基因型外，其余3個SNPs位點均為3種基因型，而微衛(wèi)星位點的基因型B1多達9種.由此可見AMY基因的多態(tài)性位點數(shù)量豐富.

衡量一個群體的遺傳多態(tài)性一般是通過計算其多態(tài)信息含量和各位點的平均雜合度來實現(xiàn)的［16］.多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的指標.當PIC≥0.5時，為高度多態(tài)性;當0.25≤PIC＜0.5時，為中度多態(tài)性;當PIC＜0.5時，為低度多態(tài)性.在翹嘴鱖群體中，AMY基因4個SNPs位點的PIC值為0.284 3－0.371 4，為中度多態(tài)性;而微衛(wèi)星位點B1在翹嘴鱖群體中的PIC值是0.650 4，屬于高度多態(tài)性.在一個群體中，多態(tài)信息含量越大，表明該位點雜合子比例越大，提供的遺傳信息越多.群體的雜合度(H)反映了被檢測位點上群體的雜合子的頻率，是群體遺傳變異的一個最適參數(shù)，雜合度越高，群體的遺傳多樣性越豐富.從表中2和表3的雜合度數(shù)值可以看出，翹嘴鱖 AMY基因的4個SNPs位點均呈中度遺傳多樣性，而微衛(wèi)星位點B1具有高度的群體多樣性，群體遺傳結構良好.有效等位基因數(shù)(Ne)是基因純合度的倒數(shù)，是反映群體遺傳變異大小的一個指標，其數(shù)值越接近所檢測到的等位基因的絕對值，說明等位基因在群體中的分布越均勻［17］.由實驗結果可知，翹嘴鱖AMY基因4個SNPs位點和微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)均接近等位基因的絕對值，表明各等位基因均勻分布于翹嘴鱖群體中.

翹嘴鱖AMY基因中共檢測到4個SNPs和一個微衛(wèi)星位點，各多態(tài)位點在群體中表現(xiàn)出了豐富的遺傳多態(tài)性.因此，本研究的5個多態(tài)性分子標記為后期研究翹嘴鱖的生長發(fā)育提供了理論基礎，對加速翹嘴鱖分子標記輔助育種的進程具有重要意義.

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