吳正潔， 王 成， 林正春

(1.北京理工大學(xué)珠海學(xué)院化工與材料學(xué)院，廣東珠海519088;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510225;3.佛山市技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究院，廣東佛山528000)

拉曼光譜是研究化合物分子受光照射后所產(chǎn)生的拉曼散射信號(hào)，能提供分子中原子振動(dòng)的信息，具有制樣簡(jiǎn)單、分析快速、無(wú)損、水干擾小，以及所檢測(cè)的樣品僅需微量即可滿足測(cè)量要求等諸多優(yōu)點(diǎn)［1］.到目前為止，激光拉曼光譜分析技術(shù)多用于樣品的定性分析［2－4］，仍較少應(yīng)用于定量分析上［5－7］，已有的定量分析的研究也都存在分析精確度不高的問(wèn)題［8－9］.我們?cè)岢鲆岳庾V中的譜強(qiáng)最高點(diǎn)作為歸一化參照的定量分析方法，并利用該方法對(duì)甲醇、乙醇進(jìn)行定量分析，其相對(duì)誤差率分別為4.7%和3.5%，具有較高的定量分析精度［10－11］.本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步拓展拉曼光譜定量分析的應(yīng)用范圍，將其用于生物樣品－血紅蛋白的定量分析上，探討拉曼光譜定量分析在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)上的適用性，并將對(duì)檢測(cè)分析過(guò)程的定量標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行討論.

1 材料與方法

1.1 人紅細(xì)胞的無(wú)菌分離

無(wú)菌抽取健康成人的靜脈血，肝素鋰抗凝，即刻以1 500 r/min速度離心10 min，去除上層血漿和脂質(zhì)體，加入3倍以上體積的細(xì)胞緩沖液，1 500 r/min的速度離心5 min，去除上清液.如此重復(fù)洗滌紅細(xì)胞3次，再將紅細(xì)胞重懸于緩沖液中.

1.2 血紅蛋白的提取

通過(guò)洗滌前面提取的正常人紅細(xì)胞、低滲使紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白、高速離心去除脂質(zhì)體、凝膠過(guò)濾層析等操作收集到血紅蛋白溶液.

將提取到的血紅蛋白，用PBS緩沖液配置成5個(gè)濃度梯度:1.489 5、1.821 3、2.808 8、2.978 8、3.448 4 mmol/L(heme).

血紅蛋白濃度的測(cè)量采用氰化高鐵血紅蛋白法，該方法是國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)及世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的測(cè)量血紅蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)方法.血紅蛋白的濃度統(tǒng)一用血紅素的摩爾濃度表示.

1.3 檢驗(yàn)樣品的制備

為了檢驗(yàn)血紅蛋白濃度定量分析的相對(duì)誤差，實(shí)驗(yàn)配置離體血紅蛋白檢驗(yàn)樣的濃度分別為:1.845 3、2.598 4、1.889 8、2.444 6、3.081 6 mmol/L.

1.4 儀器和測(cè)量條件

顯微共焦激光拉曼光譜儀為JY LabRam INV，實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件設(shè)置為60倍物鏡、200 μm共焦孔徑.照射的激光功率選擇1.5 mW，以保證激光不會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生光致?lián)p傷［12］.測(cè)量波譜范圍:600～1 800 cm－1;波數(shù)分辨率為1～2 cm－1;信號(hào)采集的曝光時(shí)間5 s.對(duì)儀器波數(shù)及激光功率的校準(zhǔn)均采用標(biāo)準(zhǔn)硅片進(jìn)行.

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

將血紅蛋白置于玻片上，采集拉曼譜.血紅蛋白樣品每個(gè)樣品測(cè)量5次，對(duì)各個(gè)拉曼譜進(jìn)行去噪、去背景、基線校準(zhǔn)后，取其平均譜.

實(shí)驗(yàn)選取每組該物質(zhì)最高濃度下拉曼譜中譜強(qiáng)最高點(diǎn)作為此組所有數(shù)據(jù)歸一化的參照，對(duì)血紅蛋白的拉曼譜進(jìn)行歸一化處理［10－11］.

選取血紅蛋白的 4 個(gè)特征譜峰［13－15］，1 356、1 471、1 546、1 608 cm－1，分別對(duì)這 4 個(gè)特征峰的峰強(qiáng)與血紅蛋白濃度作線性回歸分析，獲得各自的線性回歸方程.對(duì)比分析中采用各線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R和決定系數(shù)R2值，以及檢驗(yàn)樣在各線性回歸方程下的平均相對(duì)誤差評(píng)價(jià)各回歸方程的優(yōu)劣.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，拉曼特征峰的峰強(qiáng)與血紅蛋白濃度在1.45～3.5 mmol/L有很好的線性相關(guān)，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)的檢出限為0.461%.

2 結(jié)果與分析

波數(shù)軸的校準(zhǔn)采用標(biāo)準(zhǔn)硅片進(jìn)行，即每次測(cè)量樣品之前，將硅片特征峰校準(zhǔn)至520.7 cm－1，如圖1所示.

圖1 校準(zhǔn)前后標(biāo)準(zhǔn)硅片的特征峰圖Fig.1 Calibration of wave number from 519.6 cm－1to 520.7 cm－1by the silicon

儀器激光功率的穩(wěn)定性通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品(如標(biāo)準(zhǔn)硅片)的特征峰強(qiáng)度來(lái)衡量判斷.通過(guò)測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)硅片特征峰強(qiáng)度的變化曲線能更直觀地反映出拉曼光譜定量分析的準(zhǔn)確性.

圖2示出標(biāo)準(zhǔn)硅片的特征峰強(qiáng)度隨時(shí)間的變化值，從圖中可見，在1 h內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)硅片的特征峰強(qiáng)度在116.38±1.19波動(dòng)，變異系數(shù)CV為1.02%，數(shù)據(jù)波動(dòng)范圍小，激光功率穩(wěn)定性優(yōu)，適用于對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行拉曼光譜定量分析.

圖2 0～1 h內(nèi)測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)硅片的特征峰(520.7 cm－1)強(qiáng)度變化曲線Fig.2 The intensity of silicon Raman band at 520.7 cm －1(S)as function of time

拉曼儀經(jīng)波束軸和激光功率的校準(zhǔn)之后，可直接用于血紅蛋白樣品的檢測(cè).血紅蛋白的拉曼原始譜圖經(jīng)去噪、去背景、基線校準(zhǔn)之后得到拉曼處理譜圖，再經(jīng)前述歸一化方法處理后，得到血紅蛋白的拉曼結(jié)果譜圖，如圖3所示，血紅蛋白濃度從下到上分別為 1.489 5、1.821 3、2.808 8 mmol/L(heme).該譜圖中譜峰的相關(guān)數(shù)據(jù)，如譜峰強(qiáng)度等可直接用做定量分析.

圖3 經(jīng)去噪、去背景、基線校準(zhǔn)、歸一化處理后的血紅蛋白拉曼譜圖Fig.3 Raman spectra of hemoglobin obtained by denoising，removing the background，normalization and baseline correction

實(shí)驗(yàn)選取血紅蛋白的4個(gè)特征譜峰，1 356、1 471、1 546、1 608 cm－1，獲得譜強(qiáng)與血紅蛋白濃度的線性回歸方程，如表1所示.從所建立的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R和決定系數(shù)R2值上看，1 546 cm－1處的線性相關(guān)最優(yōu).

表1 譜峰與濃度間的線性回歸方程及其線性相關(guān)Table 1 Results of the function relation and the linear correlation between intensity of Raman bands and hemoglobin concentration

利用上述4個(gè)譜帶所獲取的線性回歸方程，對(duì)不同濃度的血紅蛋白樣品進(jìn)行檢驗(yàn)分析，各個(gè)檢驗(yàn)樣定量分析結(jié)果的相對(duì)誤差如表2所示.

從表2中可以看出，利用上述4個(gè)譜帶建立的線性回歸方程計(jì)算出的檢驗(yàn)樣品的相對(duì)誤差率，除1 471 cm－1譜帶的相對(duì)誤差波動(dòng)較大外，其他3個(gè)譜帶的相對(duì)誤差波動(dòng)較小，且平均相對(duì)誤差率均在0.058 7 ～0.094 3.說(shuō)明利用 1 356、1 546、1 608 cm－1譜峰做血紅蛋白濃度的定量分析都是可行的，分析結(jié)果的精確率較高.

表2 離體血紅蛋白檢驗(yàn)樣的平均相對(duì)誤差Table 2 The average relative error of tested hemoglobin

將1 356、1 471、1 546、1 608 cm－14 個(gè)譜峰分別應(yīng)用于定量分析后出現(xiàn)的不同結(jié)果可能與其本身譜線的歸屬性質(zhì)有關(guān)，其歸屬類型如表3所示.1 356 cm－1歸屬于去氧血紅蛋白的特征譜線，隸屬ν4，是吡咯半環(huán)對(duì)稱振動(dòng).該譜帶在514 nm激發(fā)光下處于明顯的共振模式，是血紅蛋白所有特征譜線中信號(hào)最強(qiáng)，最不易受噪聲干擾的譜帶，穩(wěn)定性高.但該譜帶對(duì)卟啉環(huán)上π－π*的躍遷非常敏感，對(duì)血紅素的氧合狀態(tài)也非常敏感，被稱為其氧化標(biāo)記帶［13－14］.血紅蛋白與氧結(jié)合后，該譜帶移至1 371 cm－1處.故選擇ν4譜線做定量分析時(shí)，只要確保血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)(處于氧合態(tài)時(shí)，可利用1 371 cm－1譜線做定量分析)，不存在既有氧合態(tài)又有去氧態(tài)的情況，便可利用本實(shí)驗(yàn)提出的歸一化方法快速、準(zhǔn)確地對(duì)血紅蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定分析.而判定血紅蛋白是否完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)，則僅需觀察血紅蛋白拉曼譜是否只出現(xiàn)1 356 cm－1譜帶或只出現(xiàn)1 371 cm－1譜帶.若兩者同時(shí)出現(xiàn)，則說(shuō)明血紅蛋白處于氧合態(tài)－去氧態(tài)的轉(zhuǎn)換過(guò)程中，此時(shí)采集的譜線，利用本實(shí)驗(yàn)采用的歸一化方法做定量分析的準(zhǔn)確度會(huì)受到影響，相對(duì)誤差高.一般而言，不建議采用去氧態(tài)和氧合態(tài)共存的血紅蛋白拉曼譜線做定量分析，若采集到的拉曼譜中兩種譜線都存在，則建議選擇兩個(gè)譜帶間譜區(qū)域的強(qiáng)度和做比值參照，這樣對(duì)改善該譜線定量分析結(jié)果的精確度會(huì)有所幫助.

表3 特征譜線的歸屬［13－15］Table 3 The assignment of Raman bands for hemoglobin

1 546、1 608 cm－1譜帶分別歸屬于 ν(CβCβ)振動(dòng)模式和ν(CαCm)不對(duì)稱振動(dòng)模式，當(dāng)使用這兩個(gè)譜帶做定量分析時(shí)，同樣受到血紅蛋白所處分子構(gòu)象(氧合態(tài)和去氧態(tài))的影響.1 608 cm－1譜帶屬于去氧血紅蛋白的特征譜線，當(dāng)血紅蛋白結(jié)合氧后，該譜帶消失，產(chǎn)生位于1 638 cm－1屬于υ10模式的譜線.血紅蛋白結(jié)合了少量的氧，但還沒有轉(zhuǎn)變到氧合態(tài)時(shí)，1 608 cm－1譜帶出現(xiàn)了強(qiáng)度降低，而1 638 cm－1強(qiáng)度升高.這時(shí)采用任一個(gè)譜帶做定量分析都是不準(zhǔn)確的.所以，同1 356 cm－1譜帶一樣，只能采用血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)時(shí)的拉曼譜圖做定量分析.選用1 546 cm－1譜帶做定量分析的前提條件與 1 356、1 638 cm－1相同.

1 471 cm－1譜帶表征－CH2的振動(dòng)模式，對(duì)血紅素的氧合狀態(tài)不敏感.選擇該譜帶作為代表，目的是討論采用對(duì)血紅蛋白變化不敏感的特征譜帶做血紅蛋白濃度定量分析的可行性.從表2的結(jié)果上看，該譜帶用于定量分析時(shí)，雖然有部分檢驗(yàn)樣得出的相對(duì)誤差較小，準(zhǔn)確性較高，但是不同檢驗(yàn)樣檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率不穩(wěn)定，波動(dòng)較大，相對(duì)誤差在0.038 3～0.376 0變動(dòng)，說(shuō)明采用該譜帶做定量分析，定量結(jié)果的隨機(jī)性較高，結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保證，該方案可行性不高.

綜上所述，對(duì)血紅蛋白采用本實(shí)驗(yàn)發(fā)展的歸一化方法進(jìn)行拉曼光譜定量分析，在判定血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)后，選取ν4譜帶如去氧合態(tài)的1 356 cm－1譜帶做定量分析的相對(duì)誤差最小，僅為0.058 7.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合歸一化方法，利用優(yōu)化的定量分析技術(shù)，對(duì)血紅蛋白的濃度進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果表明，利用該方法可以對(duì)離體血紅蛋白進(jìn)行無(wú)損、簡(jiǎn)單、快速、精確的定量分析.開創(chuàng)了拉曼光譜定量分析在生物樣品上的應(yīng)用，拓展了拉曼光譜的應(yīng)用領(lǐng)域.特別是，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物樣品的無(wú)創(chuàng)性定量檢測(cè)，有力地推動(dòng)發(fā)展了生物樣品的無(wú)損測(cè)量技術(shù).

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