池振明，馬再超

（中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島，266003）

在微生物中誘導和阻遏是非常普遍的代謝調(diào)控現(xiàn)象。在細菌中尤其在大腸桿菌（Escherichia coli）中誘導和阻遏分子機理已經(jīng)比較清楚［1］。但是在酵母菌中誘導和阻遏的分子機理明顯不同于細菌，許多詳細的分子機理，特別是與信號傳導有關的機理還很不清楚。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和其他許多酵母菌可以在各種碳源中生長繁殖，但是葡萄糖和果糖是它們生長的最適碳源。當培養(yǎng)基存在其中之一碳源時，用于分解其他碳源所需的酶合成速率就會降低或完成不能合成，這種現(xiàn)象就叫做碳代謝物阻遏作用（Carbon catabolite repression）。但是至今還未發(fā)現(xiàn)能起阻遏作用的“非葡萄糖碳代謝物”，所以更多情況下用葡萄糖阻遏作用（Glucose repression）這個名詞來代替碳代謝物阻遏作用這個說法［2］。除了葡萄糖阻遏作用外，酵母菌還存在氮代謝物阻遏作用，當培養(yǎng)基缺少富氮源如谷氨酰氨、天冬氨酸或氨時，釀酒酵母可以利用不良氮源（精氨酸、尿素、脯氨酸等）作為氮源。這時細胞中的氮阻遏作用可以在轉(zhuǎn)錄水平上得到解除，把這種現(xiàn)象叫做氮代謝物阻遏作用（Nitrogen catabolite repression），簡稱NCR［3］。許多絲狀真菌和酵母菌生長在含鐵培養(yǎng)基中時，鐵載體合成和有關基因的表達也會受到阻遏。當釀酒酵母生長在半乳糖和麥芽糖培養(yǎng)基中時，與半乳糖和麥芽糖代謝有關的基因表達和酶活力便可以得到誘導；同樣當產(chǎn)淀粉酶的酵母菌生長在淀粉、糊精和麥芽糖培養(yǎng)基中時，淀粉酶基因表達和產(chǎn)生的淀粉酶活力可以得到誘導；當產(chǎn)乳糖酶的酵母菌生長在乳糖和半乳糖培養(yǎng)基中時，乳糖酶基因和產(chǎn)生的乳糖酶活力可以得到誘導?，F(xiàn)在一般認為阻遏作用是一種影響整個細胞全局的代謝調(diào)控現(xiàn)象，也就是說一旦細胞得到葡萄糖解阻遏或氮解阻遏，許多酶的基因表達和酶活力，甚至許多代謝途徑都可以得到解阻遏，而誘導作用具有特異性，也就是說受某種物質(zhì)誘導后的細胞只能與該物質(zhì)代謝有關的基因表達和酶活力受到誘導，而與其他物質(zhì)代謝有關的基因表達和酶活力不會受到影響。這樣誘導的機理要比阻遏機理復雜的多，所以酵母菌的許多誘導機理至今仍很不清楚。

1 葡萄糖阻遏的分子機理

當培養(yǎng)基存在葡萄糖或果糖時，酵母菌代謝其他糖的酶基因表達和酶合成會受到阻遏?，F(xiàn)在一般認為這種阻遏作用主要發(fā)生受葡萄糖阻遏的各種基因轉(zhuǎn)錄水平上。參與葡萄糖阻遏的蛋白質(zhì)有2類，一類叫做Mig1（Multicopy Inhibitor of Galactose，半乳糖多拷貝抑制蛋白），另一類叫做 Snf1（sucrose non－fermentable，蔗糖非發(fā)酵蛋白）復合物，實際上Snf1復合物是一類激酶，它能催化Mig1發(fā)生磷酸化反應，也有人認為還有一類蛋白屬于連Snf1復合物激酶激酶，就是能催化Snf1復合物激酶發(fā)生磷酸化反應的酶，但是目前這種Snf1復合物激酶激酶還未知。Mig1這種蛋白質(zhì)是C2H2鋅指蛋白，它們能結合在由葡萄糖阻遏的各種基因啟動子上，結合時啟動子上必須有GC盒，含有共有序列（G／C）（C／T）GGGG，但是在與 GC盒連接的DNA 5′－端也應含有1個富含AT的區(qū)域。在酒精酵母細胞中具有Mig1和Mig2兩種蛋白?，F(xiàn)有證據(jù)表明Mig1蛋白具有2個鋅指結構，鋅指結構1能辨認G（G／A）G三聯(lián)密碼子，而鋅指結構2能辨認（G／C）（C／T）G三聯(lián)密碼子。Snf1復合物是一種蛋白質(zhì)激酶，在培養(yǎng)基中葡萄糖濃度很低或無葡萄糖情況下，在Snf復合物激酶激酶催化下，Snf1復合物受到磷酸化作用，這時它可以催化Mig1蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化反應，這時磷酸化的Mig1蛋白質(zhì)便不能與受葡萄糖阻遏的基因啟動子結合，并離開細胞核到細胞質(zhì)中，這樣有關的基因便得到了解阻遏，并進行基因表達，所以Snf1復合物在酵母菌葡萄糖阻遏作用過程中由葡萄糖引起的信號傳導途徑中起著非常重要的作用。在培養(yǎng)基葡萄糖濃度很高的情況下，Snf1復合物去磷酸化作用，這時Snf1復合物是沒有活性的，Mig1蛋白質(zhì)由于不能受到磷酸化作用，便對有關基因，如SUC2（蔗糖酶基因）基因產(chǎn)生阻遏作用［2，4］，如圖1所示。

圖1 Mig1和Snf1作用的模式圖Fig.1 The schema chart of Mig1and Snf1

在這個過程中細胞應該能感受培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，所以無疑還存在由葡萄糖引起的信號傳導作用，通過這種信號傳導作用使Snf1復合物激酶發(fā)生磷酸化作用還是去磷酸化作用。現(xiàn)在一般認為引起葡萄糖阻遏的信號就是細胞內(nèi)的葡萄糖濃度，而不是葡萄糖流入細胞的速度，所以葡萄糖本身就是1個信號分子［2］。

2 磷脂酰肌醇類信號傳導與葡萄糖阻遏的可能關系

在酵母菌細胞中的磷脂主要由磷脂酸（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和心磷脂CL）組成的。其中的磷脂酰肌醇（PI）的化學結構如圖2所示。

圖2 磷脂酰肌醇的化學結構Fig.2 The chemical structure of PI

本實驗室大量研究結果表明在釀酒酵母中蔗糖酶分泌導致的葡萄糖解阻遏作用與細胞中PI含量有某種關系，同時作者發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中蔗糖酶分泌的解阻遏作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，因為釀酒酵母分泌的蔗糖酶活力與編碼胞外蔗糖酶的mRNA量和PI含量存在有正相關性。與在釀酒酵母中的情況一樣，當粟酒裂殖酵母含有較高PI含量時，蔗糖酶分泌、細胞生長和編碼蔗糖酶的基因表達在某種程度上得到了葡萄糖解阻遏作用，并且這種葡萄糖解阻遏作用認為與細胞中較高濃度的PI含量有密切的關系。粟酒裂殖酵母的麥芽糖酶是胞內(nèi)酶，研究結果發(fā)現(xiàn)該酵母菌的磷脂酰肌醇含量與粟酒裂殖酵母麥芽糖酶基因的表達和麥芽糖酶活力也有某種關系。當酒裂殖酵母細胞PI含量增加時，能夠解除高濃度葡萄糖對麥芽糖酶活力和麥芽糖酶基因表達的阻遏作用［4－6］。

在酵母菌細胞中，PI在激酶催化下通過依賴ATP的磷酸化作用（ATP－dependent phosphorylation）可分別在肌醇分子的第4位和第5位上發(fā)生磷酸化反應，形成4，5－二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）。當細胞外的某些刺激物與細胞質(zhì)膜表面的受體結合后，可以活化對磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C（Phosphatidylinoside－specific phospholipase C，簡稱PLC），在細胞質(zhì)膜上的PLC把PIP2裂解成具有第二信使功能的1，4，5－三磷酸肌醇（IP3）和CDP－二?；视停–DP－DAG）。由于IP3是可溶性的，它便從細胞質(zhì)膜上進入細胞質(zhì)中，這時便引起細胞內(nèi)的鈣離子庫，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子庫得到釋放，細胞質(zhì)中鈣離子濃度的增加可以活化細胞中許多酶，如蛋白質(zhì)激酶（Protein kinase C，簡稱PKC）的轉(zhuǎn)位和激活，但是PKC的完全激活還需要DAG和磷脂酰絲氨酸（PS）。PKC激活后會引起pH和細胞膜的一系列變化［4］。根據(jù)這種PI類信號傳導的原理，把PI類信號傳導與上述的PI含量與葡萄糖解阻遏的關系聯(lián)系在一起，在培養(yǎng)基中添加肌醇或酵母細胞合成更多的肌醇，引起酵母菌細胞中的PI含量增加，這時即使酵母細胞生長在高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中，酵母細胞中PI含量的增加通過PI類的信號傳導作用還可以激活Snf1復合物激酶激酶，使Snf1復合物發(fā)生磷酸化反應，并同時導致Mig1發(fā)生磷酸化反應而被轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，這樣便引起蔗糖酶和麥芽糖基因表達和蔗糖酶和麥芽糖分泌進而發(fā)生葡萄糖解阻遏作用。

3 葡萄糖解阻遏與酵母菌酶的合成和調(diào)控

扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）是子囊菌屬的1個種，在營養(yǎng)生長過程中可以出現(xiàn)絲狀細胞和酵母狀細胞，是一種二形態(tài)酵母菌，它可以利用淀粉積累大量的海藻糖，并能分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶、β－葡糖苷酶和其它酶。所以扣囊復膜酵母在發(fā)酵行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和生物能源工業(yè)有著巨大的潛在應用價值［4］。在有葡萄糖存在情況下，該酵母菌許多酶的合成和基因表達都會受到阻遏。為了了解Mig1蛋白在該酵母菌葡萄糖阻遏中的作用，從扣囊復膜酵母A11菌株的基因組DNA中克隆出了MIG1基因。克隆的MIG1基因（NCBI的登錄號：HM450676）全長1 152bp，編碼由384個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其它真菌的Mig1s非常類似，有高度保守的2個鋅指結構，這2個鋅指結構可以與受葡萄糖阻遏的基因啟動子結合。在該Mig1蛋白的N－末端，有1個KPTLK的氨基酸序列，該序列決定了該蛋白可以在細胞核中定位［8］。另外該蛋白第二鋅指結構中還有1個KRFS氨基酸序列，它是依賴環(huán)化AMP的蛋白激酶催化的磷酸化位點。該蛋白也有1個含有多個谷氨酰氨的序列，所有這些特征都是Mig1蛋白必須具備的。獲得該酵母MIG1基因后，就敲除該菌株的MIG1基因，獲得了敲除菌株A11－c，它能在含有2－脫氧－D葡萄糖的平板上生長，而原始菌株A11則都不能，說明敲除菌株的葡萄糖阻遏得到了解除。與菌株A11相比，敲除菌株A11－c在72h內(nèi)產(chǎn)生的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶比活力達到了89.11，17.42，2.12 和0.20U／mg菌體干重，而野生型A11菌株在同樣條件下在72h內(nèi)產(chǎn)生的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶比活力僅達到了41.26，9.76，1.63和0.16U／mg菌體干重。同時編碼α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達量也有極大提高，由野生型A11菌株的100%α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達量提高到敲除菌株A11－c的271.2%，308.6%，190.7%和468.7%α－淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β－葡糖苷酶基因的表達量。同時發(fā)現(xiàn)敲除菌株A11－c在生長過程中多數(shù)細胞呈酵母狀細胞，絲狀細胞非常少，說明MIG1基因的敲除還可以改變該酵母細胞的形態(tài)，其中的原理還不清楚。這就證明，扣囊復膜酵母中的Mig1蛋白確實能阻遏某些基因的轉(zhuǎn)錄，它對一些基因的表達和一些胞外酶的生產(chǎn)起負調(diào)控作用［9］。

Kluyveromyces marxianus是1種能進行同宗接合的半子囊酵母菌，在親緣關系方面與釀酒酵母關系比較近，它是 Kluyveromyces lactis 的姐妹種［10－11］。該酵母最重要的特征是能夠同化乳糖和菊糖，并能利用這2種糖作為碳源［12］。由于K.marxianus能同化乳糖和菊糖、生長速率非常快、代時短、具有抗熱性和具有很強的分泌蛋白質(zhì)的能力，所以被廣泛應用在生物技術領域。該酵母菌被公認為是最安全的微生物，所以有關該酵母菌的產(chǎn)品在實際應用中沒有任何限制，這樣該酵母菌在生物技術領域中就更加廣泛了。該酵母產(chǎn)生的乳糖酶和纖維二糖酶是胞內(nèi)酶，產(chǎn)生的菊糖酶是與細胞壁結合?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該酵母的乳糖酶、菊糖酶和其他酶合成和分泌也受到葡萄糖阻遏，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（Mig1）在葡萄糖阻遏作用中起非常重要的作用［12］。所以利用含有潮霉素抗性 HPT基因的ORF框替換了工業(yè)酵母菌K.marxianus KM 的MIG1基因ORF框，獲得的敲除突變株（mig1突變株）KM－15能夠分別生長在含有潮霉素和2－脫氧－D－葡萄糖培養(yǎng)基上。與K.marxianus KM相比，突變株的β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶合成和這些酶基因的表達得到很大提高。敲除突變株KM－15產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶比活力在48h內(nèi)達到了7.2，5.7和0.06U／mg菌體干重，而K.marxianus KM在同樣條件下β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶比活力在48h內(nèi)達到了3.4、2.5和0.01U／mg菌體干重。β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶基因的表達量由K.marxianus KM的100%增加到敲除突變株 KM－15的205.5%，298%和699.6%［13］。這些研究結果表明Mig1蛋白可以調(diào)節(jié)工業(yè)酵母菌胞內(nèi)酶和細胞壁結合酶的合成和它們基因的表達，MIG1基因的敲除可以解除這些酶的合成和基因表達，大大提高酶的產(chǎn)量。同時發(fā)現(xiàn)該酵母β－半乳糖苷酶，菊糖酶和纖維二糖酶的合成分別受到了乳糖，菊糖和纖維二糖的誘導［13］。上述2個例子說明在產(chǎn)工業(yè)用酶酵母菌中敲除MIG1基因是提高酶產(chǎn)量的重要方法之一。

4 在鐵載體合成過程中阻遏機理的研究

鐵在所有生命過程中具有非常重要的作用。但是細胞中過量的鐵也是有害的，所以生物體內(nèi)的鐵濃度必須進行嚴格的調(diào)節(jié)。鐵在自然界中是1種非常豐富的元素，但是生物可利用的鐵量卻非常有限，濃度不超過10～18mol／L。在鐵濃度非常低的情況下，大多數(shù)真菌可以分泌一種特異絡合鐵的小分子化合物，即鐵載體（Siderophore），從而使環(huán)境中的鐵以可溶性的形式存在。鐵載體可以分為3類：（1）兒茶酚類（Catechols）；（2）羧酸類（Carboxylates）和（3）羥肟酸類（Hydroxamates）。但是真菌一般僅產(chǎn)生羥肟酸類鐵載體［14］。當鐵載體絡合三價鐵離子后，便被真菌吸收，在細胞內(nèi)三價鐵離子被還原成二價鐵離子，然后二價鐵離子被細胞利用。所有真菌的鐵載體合成都是從L－鳥氨酸（L－ornithine）開始，第一步反應是L－鳥氨酸的N5發(fā)生羥基化形成 N5－羥基－L－鳥氨酸（N5－h(huán)ydroxyornithine），參與催化的酶是 L－鳥氨酸－N5－羥化酶 （L－orinithine－N5－xoygenase），從某些絲狀真菌中，如曲霉中已經(jīng)克隆到編碼該酶的基因，稱為SidA或Sid1，發(fā)現(xiàn)在霉菌中這些基因的表達受到鐵離子的嚴重阻遏。第二步反應是N5－羥基－L－鳥氨酸發(fā)生烷基化反應，形成 N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸，N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸是羥肟酸鐵載體合成的基本單位。多個N5－烷基－N5－羥基－L－鳥氨酸基本單位通過非核糖體肽鍵合成酶（NRPSs）的縮合作用形成含有多個肽鍵的鏈狀或環(huán)狀化合物，如玫紅酵母酸（Rhodotorulic acid）等，如圖3所示。

圖3 真菌鐵載體合成的基本過程Fig.3 The biosynthesis of siderophore in fungi

在真菌中參與由鐵引起的阻遏作用的蛋白是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，叫做GATA蛋白，這些蛋白含有GATA類型的鋅指結構，從而可以與鐵載體合成和鐵吸收有關基因的啟動子結合。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Ustilago maydis URBS1，N.crassa SRE，P.chrysogenumSREP，A.nidulans SREA 和 Schizosaccharomyces pombe GAF2p都被鑒定為GATA蛋白，這類蛋白在大多數(shù)真菌中參與了鐵載體合成和運輸?shù)呢撜{(diào)控作用，它們都有一對鋅指結構域，以便與有關基因啟動子中含有HGATAR序列的順式片段（cis－elements）結合（其中H代表堿基A，T或C，R代表任何一個嘌呤）。比如在S.pombe中Fep1可以結合在該酵母所有已知編碼鐵吸收蛋白基因，包括frp1（還原酶），fio1（鐵氧化還原酶），fip1（滲透酶），和鐵受體基因str1－3的5′－非編碼區(qū)5′－（A／T）GATAA－3′序列上，如圖4所示。但是這些GATA蛋白如何與細胞中鐵結合后才能結合DNA或蛋白質(zhì)上或鐵離子的存在如何影響到這些GATA蛋白與有關DNA結合現(xiàn)在還不清楚。有實驗結果表明純化的重組Fep1蛋白在有鐵絡合物存在情況下不能結合在含有HGATAR序列的順式片段上，所以說Fep1與DNA結合是依賴于鐵離子的存在。也有人認為這類蛋白的鋅指結構能直接與鐵結合或通過鐵－硫簇（Iron－sulphur cluster）與鐵結合。根據(jù)上述5種阻遏蛋白（fep1，SRE，SREA，Urbs1和Sfu1）共有的氨基酸序列G（S／T）CPG（D／G）GXCNTGG，通過進一步分析發(fā)現(xiàn)它們的核心序列是GSCPGDGLCNGTGG，這是這些依賴鐵進行轉(zhuǎn)錄阻遏的蛋白特有的保守序列。在某些情況下，這些蛋白必須與共阻遏蛋白，如圖4所示的Tup11或Tup12一起才能發(fā)揮功能，所以這些GATA蛋白是作為多蛋白復合物的一部分發(fā)揮功能，如圖4所示。

圖4 通過GATA蛋白Fep1進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式圖Fig.4 Schema chart of the transcriptional regulation through GATA protein Fep1

Fep1是裂殖酵母菌中許多基因的1種轉(zhuǎn)錄共阻遏蛋白，負責鐵吸收的調(diào)控作用。這類蛋白能通過一對鋅指結構域特異地與順式片段（GATA Box）結合，這種結合作用是在鐵過量情況下進行的，結合后與鐵載體合成和鐵運輸有關的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成就受到阻遏。當培養(yǎng)基缺鐵時，F(xiàn)ep1離開GATA Box，與鐵載體合成和鐵運輸有關的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成就開始合成。

本實驗室從海洋酵母菌種庫的300多株海洋酵母中利用高氯酸鐵檢測的方法篩選得到14株產(chǎn)鐵載體的酵母，經(jīng)過復篩得到一株鐵載體產(chǎn)量較高的海洋酵母菌菌株HN6.2，該菌株分離自青島東風鹽場近海表層海水。通過鑒定，發(fā)現(xiàn)該株海洋酵母菌屬于普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans）。在最佳條件下培養(yǎng)，HN6.2菌株的鐵載體最高產(chǎn)量可達到1.1mg／mL。在產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中加入L－鳥氨酸后鐵載體的產(chǎn)量明顯增加，而加入Fe3＋后，其產(chǎn)量明顯減少。并且，從分子水平上檢測到了L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因在加有L－鳥氨酸培養(yǎng)基中表達量上升，而加有Fe3＋情況下該基因表達量非常低。該菌株HN6.2產(chǎn)生的鐵載體對海洋鰻弧菌V.P、海洋副溶血弧菌 W－1和枯草桿菌具有明顯的抑菌活性，并且對海洋鰻弧菌V.P的抑菌活性最大。同時，發(fā)現(xiàn)Fe3＋對鐵載體的抑菌作用具有抑制作用。該鐵載體的熱穩(wěn)定性很強，對鐵載體進行加熱處理后，仍具有同樣的抑菌活性［15］。經(jīng)過純化、紅外光譜和質(zhì)譜法分析，發(fā)現(xiàn)該鐵載體的結構組分是異羥肟酸類Fusigen，如圖5所示［16］。純化的鐵載體仍具有抑菌活性。

從圖5的化學結構可以看出Fusigen合成的第一步反應也是L－鳥氨酸的5位N原子發(fā)生羥基化形成N5－羥基－L－鳥氨酸，但是在該鐵載體合成過程中 N5－羥基－L－鳥氨酸不發(fā)生烷基化反應，而是 N5－羥基－L－鳥氨酸直接作為鐵載體合成的基本單位。3個N5－羥基－L－鳥氨酸基本單位通過非核糖體肽鍵合成酶（NRPSs）的縮合作用形成含有3個酯鍵的環(huán)狀化合物（見圖5）。目前該L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因包括上游的非編碼區(qū)和下游的終止序列已經(jīng)得到了克隆，命名為SidA基因，登錄號為FJ769160。該基因的ORF框大小為1 461bp，編碼1個由486個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（等電點7.79），推測的分子量為55.4kD。該基因（無內(nèi)含子）啟動子位于－1～－824bp，并且具有3個HGATAR boxes和1個CATA box，推測前者就是阻遏蛋白（GATA蛋白）結合的結構域，所以就出現(xiàn)了上述的由鐵離子引起的鐵載體合成和L－鳥氨酸－N－羥基化酶基因表達的阻遏現(xiàn)象。把該基因敲除后獲得的敲除菌株S6（ΔsidA）不能合成胞內(nèi)和胞外的鐵載體，所以培養(yǎng)的上清液不能抑制病原菌Vibrio anguillarum 和Vibrio parahaemolyticus的生長。敲除菌株S6在完全缺鐵的培養(yǎng)基上和海水中因為細胞出芽停止不能生長，但是在培養(yǎng)基添加上10μmol／L Fe3＋和Fe2＋后就可以生長。與野生型菌株相比，培養(yǎng)基中的H2O2對敲除菌株的毒性要大得多，因為在細胞中沒有鐵載體來儲存鐵，這樣過多的鐵會導致過量過氧化合物的形成。所以推測該酵母產(chǎn)生的鐵載體fusigen在絡合、吸收和濃縮鐵方面能發(fā)揮獨特的作用，以維持細胞某些特殊的生理功能。另外該酵母能分泌具有抑制其他微生物生長的鐵載體，這樣可以排除競爭者，在海洋環(huán)境中能更好地獲得有限的營養(yǎng)物［17］。

5 氮阻遏機理的研究現(xiàn)狀

在釀酒酵母中所有與氮代謝（包括谷氨酰氨、谷氨酸、脯氨酸、尿素、精氨酸、含氮的γ－氨基丁酸（GABA）和尿囊素合成）有關的已知途徑受到了4個調(diào)節(jié)蛋白Gln3，Gat1，Dal80和Deh1的調(diào)控，這些蛋白可以結合到受調(diào)控基因啟動子的共有序列5′－GATAA－3′上。Gln3和Gat1結合有利于有關基因的表達，所以它們是轉(zhuǎn)錄激活蛋白，而Dal80和Deh1的結合不利于有關基因的表達，所以它們是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白。另外氨基酸滲透酶和氨滲透酶基因的表達也受到這4個蛋白的調(diào)控。該酵母蛋白酶基因的表達同樣也受到Gln3，Gat1，Dal80和Deh1的調(diào)節(jié)，因為這些基因編碼的蛋白酶可以把蛋白質(zhì)降解成氨基酸，從而給細胞提供氮源，這樣培養(yǎng)基存在這些氨基酸同樣也會產(chǎn)生氮阻遏和解阻遏作用。谷氨酸和谷氨酰氨是細胞合成所有氨基酸的前體物。當培養(yǎng)基中不存在谷氨酰氨、天冬氨酸或氨時，編碼合成脯氨酸、尿素、精氨酸、含氮的γ－氨基丁酸（GABA）和尿囊素合成的基因表達可以在轉(zhuǎn)錄水平上得到解阻遏，因為細胞無法直接從谷氨酰氨、天冬氨酸或氨合成其他的氨基酸。Gln3含有730氨基酸，在306～330氨基酸區(qū)域中有1個Cys2／Cys2鋅指結構，它能結合在含有5′－GATA／TA－3′Gln3DNA 序列中，把這段序列叫做上游激活序列UASNTR。在含有谷氨酰氨、天冬氨酸或氨的阻遏培養(yǎng)基中，Gln3的功能受到阻遏，其中谷氨酰氨是引起阻遏的信號分子，當天冬氨酸或氨被轉(zhuǎn)化成谷氨酰氨時能起同樣的作用。Gat1是能引起氮阻遏途徑基因解阻遏的第二個激活蛋白，像Gln3蛋白一樣，Gat1也含有1個與DNA結合的鋅指結構，但是當培養(yǎng)基中谷氨酸濃度增加時Gat1失去活力，而氨濃度增加時Gat1具有活力。像Gln3蛋白一樣，作為1種阻遏蛋白Dal80能結合在啟動子含有5′－GATAA－3′的DNA序列中；這些DNA序列被命名為上游阻遏序列URSGATA。編碼Dal80的基因DAL80含有807個堿基，編碼269個氨基酸。如果氮代謝途徑的基因啟動子含有URSGATA序列，Dal80能夠阻遏這些基因表達。如果啟動子中的2個5′－GATAA－3′序列是尾對尾或頭對頭相連，那么 Dal80結合在URSGATA上最為牢固。基因DAL80的表達依賴于Gln3，在含有脯氨酸解阻遏培養(yǎng)基中它會阻遏它自己的表達。在含有谷氨酰氨、天冬氨酸和氨的阻遏培養(yǎng)基中它不會影響GLN3，GAT1或DEH1基因的表達，但是在解阻遏培養(yǎng)基中會影響GLN3，GAT1或DEH1基因的表達。與Dal80一樣，在含有谷氨酰氨、天冬氨酸和氨的豐富培養(yǎng)基（阻遏培養(yǎng)基）中產(chǎn)生的Deh1是一種阻遏蛋白，能阻遏與氮代謝過程中的許多基因表達。它含有551個氨基酸，與Dal80有很高的同源性：C－末端有1個假定的亮氨酸拉鏈結構（Putative leucine zipper）和鋅指結構，這些鋅指結構與其他真菌和人類的Gln3，Gat1，Dal80和各種GATA因子有很高的同源性。與Gln3和Gat1所不同的是，Deh1和Dal80沒有酸性區(qū)域，所以不能參與轉(zhuǎn)錄激活作用［3］。

上述能與GATA結合的蛋白質(zhì)是氮代謝物途徑中的4種主要調(diào)節(jié)蛋白，所有這些蛋白具有很高的同源序列，都能辨認啟動子中的5′－GATAA－3′的序列。Dal80和 Deh1與啟動子中的5′－GATAA－3′序列結合后，能拮抗Gln3和Gat1的結合，所以阻遏了許多基因的轉(zhuǎn)錄，所有這些調(diào)節(jié)蛋白都存在于阻遏和解阻遏培養(yǎng)基中，但是在解阻遏培養(yǎng)基中Gln3和Dal80是主要的調(diào)節(jié)蛋白，而在阻遏培養(yǎng)基中Gat1和Deh1是主要的調(diào)節(jié)蛋白。通過這種方式完成完全阻遏（含有谷氨酰氨）到完全解阻遏（含有脯氨酸）過程［3］。

6 誘導機理的研究現(xiàn)狀

與阻遏現(xiàn)象一樣，酵母菌許多酶的合成和代謝途徑都會受到底物的誘導?，F(xiàn)在認為在酵母菌誘導過程中，轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Transcriptional activator）起著非常關鍵的作用，轉(zhuǎn)錄激活蛋白最重要的特征是含有鋅指結構，能與許多基因的啟動子結合，起轉(zhuǎn)錄激活作用。這類蛋白還有一個很重要的特征就是有特異性，就是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白只能調(diào)控一種物質(zhì)的代謝。它們可以分為3類，第一類是C2H2蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列是 Cys－X2－4－Cys－X12－His－X3－5－His；第二類是C4蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列如下：Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys－Xn－Cys－X2－Cys；第三類是C6蛋白，這類蛋白共有的氨基酸序列如下：Cys－X2－Cys－X6－Cys－X5－12－Cys－X2－Cys－X6－8－Cys， 這類鋅指蛋白含有6個半胱氨酸和2個鋅原子，所以通常被稱作為Zn（II）2Cys6或者（Zn2C6），它們是真菌中特有的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。轉(zhuǎn)錄激活蛋白二級結構變化非常大，并且功能多樣。指狀結構實際上是由1個α－螺旋和1對反平行β－折疊鏈組成的。通常情況下，有1個或多個鋅原子與氨基酸Cys或His結合，這種結合有利于結構域的穩(wěn)定性，并且對該類蛋白有合適的結構和功能具有重要的作用［18］。

轉(zhuǎn)錄激活蛋白除了具有富含半胱氨酸的DNA結合結構域（DNA binding domains，DBD）外，還有調(diào)節(jié)和激活結構域，如圖6所示。轉(zhuǎn)錄激活蛋白的功能結構域包括鋅指（Zinc finger）、接頭（Linker）、二聚體區(qū)域（Dimerization）、調(diào)節(jié)結構域（Regulatory domain）和酸性區(qū)域（激活結構域）（Aciddic region），其中鋅指、接頭和二聚體區(qū)域3部分統(tǒng)稱為DNA結合結構域DBD。鋅指一般位于N－末端，負責與被誘導基因啟動子的結合，它所辨認的啟動子一般含有CGG三聯(lián)密碼子，當然該三聯(lián)密碼子附近的核苷酸也會在某種程度上影響DBD與DNA結合的親和力，另外該三聯(lián)密碼子的方向性和三聯(lián)密碼子之間的空間對于DBD與DNA結合也有影響。接頭決定了DBD與被誘導基因啟動子結合的特異性。二聚體區(qū)域決定了2個轉(zhuǎn)錄激活蛋白同時結合到被誘導基因啟動子上，并且對蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起某種作用。調(diào)節(jié)結構域在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活蛋白的轉(zhuǎn)錄活力方面起某種作用。酸性區(qū)域通常位于C－末端，主要的功能是作為激活結構域，它們不是很保守的結構域，并且結構功能多樣［18］。

圖6 轉(zhuǎn)錄激活蛋白的功能結構域Fig.6 The functional domain of transcriptional activator

在有誘導物存在情況下，酵母菌轉(zhuǎn)錄激活蛋白如何激活有關基因的表達現(xiàn)在還不完全清楚。這方面研究最多的是酒精酵母中與半乳糖代謝有關的Gal4p這種轉(zhuǎn)錄激活蛋白。這種激活蛋白可以激活與半乳糖和蜜二糖代謝有關的一系列基因表達，如GAL1，GAL2，GAL7，GAL10和MEL1。在沒有DNA存在情況下，Gal4p是以單體的形式存在，當它的鋅指與DNA含有CCG三聯(lián)密碼子結合時是以二聚體的形式存在。Gal4p可以與調(diào)節(jié)蛋白Gal80形成一個復合物，這種復合物的形成需要Gal4p蛋白C－末端存在的30個氨基酸［2，18］。

在培養(yǎng)基沒有半乳糖存在情況下，這種復合物可以與受誘導基因的上游激活序列UASGAL結合，但是這時不能激活轉(zhuǎn)錄作用（見圖7A）［2，18］。

當培養(yǎng)基中存在半乳糖時，一種類似于半乳糖激酶的調(diào)控蛋白Gal3p首先與半乳糖結合，然后再與Gal4p－Gal80復合物結合，從而解除了Gal80對Gal4p活力的抑制作用，有關的基因轉(zhuǎn)錄便開始（見圖7B）。Gal3p－半乳糖復合物能影響GAL基因的表達是由于這種復合物能使Gal4p－Gal80p復合物發(fā)生構象變化，從而使Gal4p的激活結構域能和普通的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用。在沒有半乳糖存在情況下，Gal80可以通過改變激活結構域而抑制 Gal4p活力［2，18］。

Gal4p蛋白上的許多氨基酸可以得到磷酸化反應。在不受誘導情況下，磷酸化和去磷酸化的Gal4p形式都可以存在于細胞中。在有誘導物半乳糖存在情況下，Gal4p其中之一的氨基酸（Ser－699）出現(xiàn)磷酸化后，這時Gal4p具有激活有關基因的轉(zhuǎn)錄作用，Ser－699氨基酸發(fā)生磷酸化作用對于Gal4p發(fā)生最大的轉(zhuǎn)錄激活作用能起關鍵的作用（見圖7C）。RNA Pol II全酶中的細胞周期蛋白依賴性激酶（The cyclin－dependent protein kinases of the RNA Pol II holoenzyme）參與了這種磷酸化作用。在上述磷酸化過程中，還有一個蛋白還參與了作用，那就是Srb10p，在Srb10p有活力情況下，Gal4p的Ser－699才能發(fā)生磷酸化作用，從而使Gal4p－Gal80p復合物處在有活力的構象，如果Srb10p能使Gal4p發(fā)生磷酸化作用，那么Srb10p就可以加快GAL基因的誘導作用（見圖7C）［2，18］。現(xiàn)在的問題是半乳糖的存在如何使Gal4p的Ser－699發(fā)生磷酸化反應，其中有可能發(fā)生信號傳導作用。

當培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，這時培養(yǎng)基中即使有半乳糖存在，與半乳糖代謝有關的GAL基因轉(zhuǎn)錄也會受到阻遏。葡萄糖可以在不同水平上作用于Gal4p，通過Mig1蛋白質(zhì)阻遏它的合成，如上述、阻止它與上游激活序列UASGAL的結合、干擾Gal4p的激活功能。另外還會干擾半乳糖－Gal3－Gal4p－Gal80復合物抑制作用的解除。另外一種可能是由于在有Gal80存在情況下，葡萄糖可以抑制Gal4p發(fā)生磷酸化作用［2，18］。

在非誘導情況下（沒有加半乳糖情況下），轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p活力受到負調(diào)控蛋白Gal80p的抑制（A）。當加入半乳糖后（B），半乳糖與Gal3p結合成復合物，該復合物與Gal80p相互作用導致Gal4p構象發(fā)生瞬間變化，使得Gal4p轉(zhuǎn)錄激活蛋白具有激活轉(zhuǎn)錄作用。在與RNA Pol II全酶作用過程中（C），轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p的Ser－699受到Srb10p的磷酸化作用，這種磷酸化作用使得受Gal3p－半乳糖誘導的Gal4p－Gal80p構象得到激活，這樣激活有關基因的表達。轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4p中的Ser－699受到Srb10p的磷酸化作用是受到單獨的環(huán)境信號調(diào)［2，18］。

圖7 釀酒酵母半乳糖酶的誘導機理Fig.7 The induction mechanism of GAL in S.cerevisae

7 展望

從上述情況來看，目前僅對釀酒酵母誘導機理有所了解。同時發(fā)現(xiàn)參與誘導作用的關鍵組分轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因表達也受到葡萄糖阻遏。轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白Mig1可以調(diào)控細胞中許多受葡萄糖阻遏的基因表達，但是轉(zhuǎn)錄激活蛋白對調(diào)控的基因具有特異性，比如說Gal4p只能調(diào)控釀酒酵母半乳糖和蜜二糖的代謝，對其他物質(zhì)的代謝沒有調(diào)控作用。目前許多酵母菌糖代謝和活性物質(zhì)代謝也受到了誘導調(diào)控，如上述的扣囊復膜酵母菌淀粉酶合成、纖維二糖酶合成和酸性蛋白酶合成分別受到淀粉、糊精、麥芽糖、纖維二糖和蛋白質(zhì)的誘導、馬克斯克魯氏酵母菌乳糖酶合成、菊糖酶合成和纖維二糖酶合成受到乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖、纖維二糖的誘導、另有一株普魯蘭酵母鐵載體合成受鳥氨酸誘導。這些酵母的誘導機理是否與酒精酵母的Gal4p調(diào)控作用一樣，現(xiàn)在還一無所知。這就需要人們在這些酵母菌克隆更多的轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因，并通過基因敲除實驗驗證轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因與誘導的關系。這些轉(zhuǎn)錄激活蛋白與基因啟動子的結合是否需要淀粉、糊精、麥芽糖、蛋白質(zhì)、纖維二糖、乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖和鳥氨酸的參與；在培養(yǎng)基中的淀粉、糊精、麥芽糖、蛋白質(zhì)、纖維二糖、乳糖、半乳糖、菊糖、蔗糖和鳥氨酸與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的磷酸化和有關基因的表達存在何種關系；轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因的表達與葡萄糖阻遏之間的關系如何；在不同酵母菌中和不同物質(zhì)引起的誘導機理是否一樣；在不同轉(zhuǎn)錄激活蛋白中哪一種對有關的基因表達誘導最有效；過量表達這種轉(zhuǎn)錄激活蛋白是否可以增加有關酶的產(chǎn)量，所有這些問題都是將來需要進行深入的研究。同樣許多阻遏機理也完全未知，如上述在鐵載體合成過程中由GATA蛋白參與的阻遏作用是否需要鐵離子存在，鐵離子如何與GATA蛋白結合，然后發(fā)揮阻遏有關基因表達的作用。

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