鞏龍靜，馬 君＊＊，周涵婧，劉 澍，周正華，毛偉征，鄭榮兒

（1.中國海洋大學(xué)光學(xué)光電子實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266100；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院普外科，山東 青島266071）

胃癌在我國發(fā)病率居各類腫瘤之首，目前其診斷方法主要有X射線、胃鏡、超聲等，以病理檢驗(yàn)為準(zhǔn)，大都耗時、有創(chuàng)，尋找新的診斷方法仍是臨床研究的重要課題。光譜診斷惡性腫瘤具有實(shí)時、無創(chuàng)的特點(diǎn)，是物理學(xué)與醫(yī)學(xué)結(jié)合探索腫瘤診斷的熱點(diǎn)問題。

拉曼光譜是物質(zhì)固有的分子振動光譜，它反映了分子的結(jié)構(gòu)信息。研究表明，組織在癌變后，其核酸、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、脂類等物質(zhì)的含量及結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，這些變化會相應(yīng)的反映在拉曼光譜上，拉曼光譜能從分子水平上鑒別癌。但因拉曼散射截面很小，組織常規(guī)拉曼信號較弱，易被強(qiáng)熒光背景湮沒。基于粗糙表面的表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface－Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）技術(shù)可使拉曼信號提高十幾個數(shù)量級，在適當(dāng)條件下，SERS可以檢測到單分子水平，具有很高的檢測靈敏度［1－2］。相比普通拉曼光譜，金屬團(tuán)簇會淬滅簇?fù)矸肿拥臒晒?，使拉曼光譜的信噪比大大提高，且它對生物分子沒有損傷，非常適合生物醫(yī)學(xué)研究。劉燕楠小組［3］利用銀溶膠對肺癌及正常組織進(jìn)行了SERS探測，對比分析了兩者的特點(diǎn)與差異；S.CIntǎPInzaru等［4］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌上皮組織的SERS主要來自DNA或RNA堿基的拉曼信號；陳榮小組［5－6］先后對鼻咽癌和甲狀腺癌組織進(jìn)行了SERS研究。胃癌組織的SERS探測尚未見報道。

本文在自體熒光光譜和拉曼光譜識別胃癌研究工作［7－8］的基礎(chǔ)上，以金溶膠為基底，對胃癌及正常組織、組織勻漿和上清進(jìn)行SERS探測和分析，以期尋找快速、無創(chuàng)診斷胃癌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料的制備

標(biāo)本來源及制備 選擇2010年手術(shù)治療的胃癌病人21例，男14例，女7例，平均年齡63.4歲。剪開切除的胃組織，胃癌組織取自肉眼胃癌最明顯處，正常組織取自癌旁6cm以上不含癌的正常胃壁，每處1×2cm2；分成3塊，行病理檢查確診，用于光譜測量，按100g／L制成組織勻漿，勻漿1 000r／min離心20min，取上層清液得組織勻漿上清液（以下簡稱上清）。

試劑來源 制備金溶膠的藥品氯金酸和檸檬酸鈉產(chǎn)于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純；D－葡萄糖（glucose，Glu）和L－苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）產(chǎn)于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，L－酪氨酸（tyrosine，Tyr）產(chǎn)于天津市博迪化工有限公司，膽固醇（cholesterol，Cho）產(chǎn)于天津市大茂化學(xué)試劑廠，L－色氨酸（tryptophane，Trp）產(chǎn)于上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司，小牛胸腺DNA產(chǎn)于美國SIGMA公司，型號為D－1501。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

金溶膠制備 利用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備金溶膠［9］，具體步驟如下：30mL濃度為2×10－3mol／L的氯金酸水溶液放置磁力攪拌器上加熱到沸騰，攪拌下緩慢加入10mL濃度為5.4×10－3mol／L的檸檬酸鈉水溶液，沸騰狀態(tài)下繼續(xù)攪拌1h，室溫下冷卻。圖1為金溶膠的掃描電鏡圖像及消光光譜（左上角），金納米顆粒的平均直徑約為58nm，吸收峰在534nm，近紅外區(qū)的吸收較高，適于近紅外激發(fā)光的拉曼探測。

圖1 金溶膠的掃描電鏡圖像及消光光譜Fig.1 The SEM and extinction spectrum of pure Au colloids

1.2 拉曼光譜系統(tǒng)及探測

本文選用785nm連續(xù)激光作為激發(fā)光，經(jīng)Y型光纖探頭傳入樣品表面，照射到樣品表面的光功率為25mW。后向散射光經(jīng)收集光纖耦合進(jìn)入QE65000型光譜儀（美國Ocean Optics公司），光譜儀分辨率為6cm－1，掃描范圍0～2 000cm－1，積分時間均取30s，由 Ocean－Optics自帶軟件進(jìn)行光譜記錄。光譜實(shí)驗(yàn)均在暗室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中利用DH－2000－VIS校準(zhǔn)燈（美國Ocean Optics公司）對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行強(qiáng)度校準(zhǔn)。

將組織標(biāo)本放在石英片上行拉曼光譜探測后，放入盛0.5mL金溶膠的比色皿中，探測組織表面3～5處不同點(diǎn)的SERS；分別探測組織勻漿和上清的拉曼光譜及其與金溶膠混合的SERS。每組測量3次取平均。

圖2 SERS的增強(qiáng)效果圖Fig.2 The enhancemant effect of SERS

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2a－c是組織、勻漿和上清的SERS，d－f為組織、上清和金溶膠的拉曼光譜。結(jié)果顯示：組織在1 002、1 449和1 653cm－1存在很弱的拉曼峰，加入金溶膠后，組織、勻漿和上清的拉曼信號均有明顯增強(qiáng)，在623、656、724、828、963、1 032、1 087、1 128、1 244、1 329、1 367、1 471、1 597和1 723cm－1出現(xiàn)新的拉曼峰，在1 002cm－1處的拉曼信號變化不大，但在1 449和1 653cm－1處的信號被湮沒，這可能是由于金溶膠對不同物質(zhì)的吸附性不同引起的；金溶膠對組織、勻漿及上清拉曼信號的增強(qiáng)效果依次增大，特別在1 087與1 128cm－1處的強(qiáng)度比I1087／I1128分別為0.69、1.83和2.06。金溶膠的拉曼信號較弱，不會對探測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

考慮生物組織的拉曼光譜的主要集中范圍及光譜儀響應(yīng)范圍，選取400～1 800cm－1范圍光譜進(jìn)行分析。利用光譜儀所測得的標(biāo)準(zhǔn)燈的曲線與給定的標(biāo)準(zhǔn)曲線對每條光譜強(qiáng)度校準(zhǔn)后，進(jìn)行去背景處理，以消除光譜儀的響應(yīng)效率、噪聲、熒光背景等對光譜的影響。

2.1 組織、勻漿和上清的SERS

圖3 上清的SERS與組織中常見物質(zhì)的拉曼光譜對比圖Fig.3 The Comparison diagram of SERS of Supernatant of homogenized tissue and Raman spectra of common materials

表1 光譜特征峰的歸屬及生物分子來源Table 1 Tentative biochemical assignment for the raman peaks

圖4 胃癌與正常上清的典型SERSFig.4 Typical SERS of normal and malignant gastric supernatant of homogenized tissues

圖5 胃癌與正常組織的典型SERSFig.5 Typical SERS of normal and malignant gastric tissues

為分析拉曼特征峰的歸屬，對生物中常見的幾種物質(zhì)：小牛胸腺DNA、膽固醇、酪氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、色氨酸的固體進(jìn)行了光譜探測，并與上清的SERS進(jìn)行對比（見圖3），發(fā)現(xiàn)：相對于固體的拉曼峰，上清的SERS存在7cm－1以內(nèi)的頻移，特征峰的相對強(qiáng)度也有明顯變化，這是由于當(dāng)分子吸附在金納米顆粒表面時，電荷轉(zhuǎn)移使吸附分子的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小變化［10］，屬于化學(xué)吸附范疇。上清的SERS峰較寬，分析可見是多種物質(zhì)的拉曼信號疊加的結(jié)果?？蓺w屬至DNA的 峰 有724、1 244、1 329、1 367和1 471cm－1，此 外，DNA固體PO2－的對稱伸縮振動在1 098cm－1，而加入金溶膠后，組織在1 087cm－1峰比較強(qiáng)，可能是由于DNA單、雙鏈發(fā)生了斷裂［11］；可歸屬至膽固醇的有963、1 087和1 128cm－1；可 歸 屬 至 D－葡 萄 糖 的 有1 032、1 128和1 329cm－1；可歸屬至 L－苯丙氨酸的有623、828、1 002、1 032和1 597cm－1；可歸屬至 L－色氨酸的有623和1 367cm－1；可歸屬至L－酪氨酸的有828和1 329cm－1。根據(jù)上述結(jié)果及文獻(xiàn)［3－6，11－13］，確定各特征峰的歸屬，如表1所示。分析圖2、3和表1發(fā)現(xiàn)，金溶膠對組織、勻漿及上清的SERS中724、963、1 087、1 128、1 244、1 329、1 367、1 471、1 597、1 723cm－1等處的峰增強(qiáng)效果特別明顯，這些峰主要?dú)w屬于核酸、蛋白質(zhì)、糖類及脂類上，尤其增強(qiáng)效果最為突出的724、1 471、1 597cm－1等峰可以歸屬至核酸的腺嘌呤。2.2胃癌與正常組織的SERS

為消除激發(fā)光能量及光譜收集效率的變化對整個光譜的影響，對光譜進(jìn)行面積歸一化處理，分析胃癌與正常上清、組織的SERS的差異，分別見圖4和圖5。從圖4可以看出，相比正常上清的SERS，癌上清在623、724、1 087、1 471、1 597和1 723cm－1處峰強(qiáng)度較高，在828、1 002和1 032cm－1處峰強(qiáng)度較低。圖5顯示，相比正常組織，癌組織在724、1 329、1 367和1 597cm－1處峰強(qiáng)度較高，在828和1 002cm－1處峰強(qiáng)度較低。

為反映癌組織光譜強(qiáng)度Ic與正常組織光譜強(qiáng)度In的差異，利用全部病例的平均光譜，定義癌組織相對于正常組織SERS光強(qiáng)的相對變化率λ＝（Ic－In）／In（見表2）。分析可得，癌組織中核酸的含量較高，大部分蛋白質(zhì)的含量較低，糖類及脂類的含量也較低。

表2 胃癌與正常的組織和上清主要差異特征峰光強(qiáng)的相對變化率（λ）。Table 2 The relative－change rate of SERS of tissues and supernatant between cancerous and normal tissues

3 討論

以金溶膠為基底，組織、勻漿和上清的SERS的信號有明顯增強(qiáng)，其中上清增強(qiáng)效果最好。組織在勻漿研磨過程中，對細(xì)胞膜有一定的損傷，造成細(xì)胞破裂，增大了金溶膠與細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤等物質(zhì)的作用機(jī)會，這可能是金溶膠對組織勻漿及上清拉曼信號的增強(qiáng)效果遠(yuǎn)好于金溶膠直接作用于組織的原因。而組織勻漿中仍含有組織碎屑，會對納米顆粒與物質(zhì)的相互作用及光在樣品中傳輸產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致組織勻漿的SERS效果稍差于上清。勻漿及上清SERS中I1087／I1128的增大可能是由勻漿和上清中與金溶膠相互作用的核酸的量較多引起的。此外，同一種樣品的SERS中，核酸腺嘌呤的增強(qiáng)效果最為突出，可能是由于其與金溶膠的吸附性較好，腺嘌呤常用作SERS的探針分子，其與納米顆粒的相互作用機(jī)理目前仍是人們研究的熱點(diǎn)問題［14］。

對胃癌和正常組織、上清SERS間的差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，癌組織中大部分蛋白質(zhì)、糖類及脂類的含量較低，核酸的含量較高。醫(yī)學(xué)研究表明，癌細(xì)胞的新陳代謝較正常細(xì)胞活躍，導(dǎo)致大部分的蛋白質(zhì)、脂類及提供能量的糖類消耗較大，難以在組織和細(xì)胞中聚集，因而在癌組織中的含量較低［15］。癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)別主要體現(xiàn)在細(xì)胞核上，癌細(xì)胞具有無限增殖的能力，DNA大量復(fù)制，且增殖過程中可能會出現(xiàn)二倍體、三倍體及可見的巨核、雙核、多核情況，細(xì)胞核質(zhì)比增加，這些可能造成胃癌組織核酸的含量較高［11］。

4 結(jié)語

本文以金溶膠為基底，采用近紅外拉曼光譜系統(tǒng)，對21例手術(shù)治療的胃癌病人的癌變與正常組織的組織、勻漿及上清進(jìn)行SERS探測。胃組織的SERS信號比普通拉曼信號有明顯的增強(qiáng)，且核酸腺嘌呤的信號尤其突出，鑒于金溶膠對核酸腺嘌呤的增強(qiáng)作用顯著的優(yōu)勢，SERS在癌癥識別方面擁有巨大的潛力，有望成為胃癌臨床診斷的一種新方法。

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