麻麗丹，王殿夫，王多春，曹際娟

（1.丹東出入境檢驗檢疫局，遼寧 丹東，118000；2.遼東學院畜牧獸醫(yī)系，遼寧 丹東，118000；3.國家疾控中心腹瀉重點實驗室，北京，102206；4.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連，116001）

霍亂是一種急性腸道傳染病，對一些亞洲和非洲國家來說目前仍是嚴重的公共衛(wèi)生問題，霍亂弧菌主要通過受污染的水和食物傳播，與不嚴格的環(huán)境管理密切相關。因此，加強霍亂弧菌環(huán)境水體監(jiān)測，可提供環(huán)境污染危險性的評價及對傳播來源的分析，為制定霍亂防控對策提供科學依據(jù)，是霍亂防治工作的重要組成部分，同時，對環(huán)境水體的霍亂弧菌的監(jiān)測可作為霍亂流行的預警指標［1－4］。水體中的霍亂弧菌檢測通常是采用傳統(tǒng)的濃縮堿性蛋白胨增菌法。國家衛(wèi)生部編制的《霍亂防治手冊》及GB15984－1995《霍亂診斷標準及處理原則》首選方法也是此法（以下簡稱常規(guī)法）。但在霍亂的非流行期，霍亂弧菌在外環(huán)境水體中自然生存狀態(tài)下菌量較少，同時由于外環(huán)境水體中存在大量其它雜菌，會對霍亂弧菌的分離鑒定產生干擾；另外，霍亂弧菌可以以活的非可培養(yǎng)及生物膜狀態(tài)存在，常規(guī)培養(yǎng)無法檢測到，對監(jiān)測技術研發(fā)提出了更高的要求。并且研究顯示，非O1群和非O139群霍亂弧菌也能引起霍亂的爆發(fā)，造成在疫情監(jiān)測和調查中產生誤差，不適應烈性傳染病的監(jiān)測需要［5－12］。

針對這些不足，為了提高外環(huán)境水體中霍亂弧菌的檢出率，減少漏檢的可能性，在確保標本采集和增菌的技術質量前提下，作者將實時熒光PCR（real time fluorecent PCR）運用于對霍亂弧菌的快速篩選。實時熒光PCR檢測是近幾年發(fā)展起來的PCR技術，具有快速、特異、敏感的特點，可對樣品進行精確定量。本研究以霍亂弧菌（O1群和O139群）O抗原編碼基因（rfb）和特異性的溶血素基因（hlyAA）序列為靶序列［13－14］，建立三重實時熒光 PCR的實驗方法，為水體標本霍亂弧菌的初篩與純培養(yǎng)物鑒定提供了一條可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

霍亂弧菌國際標準菌株N16961（O1群）、MO45（O139群）、O1群 El Tor型霍亂弧菌30株（2002—2008年分離），O139群霍亂弧菌5株（2003—2006年分離），非O1／非O139群霍亂弧菌25株（2007—2008年分離）以及O22和N53、以及擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥氏弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、嗜水氣單胞菌等8種環(huán)境水體中能分離到的弧菌。實驗菌株均經過血清或生化鑒定，本室保存。

1.2 引物和探針的設計

根據(jù)O1群和O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb序列和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）序列，使用Oligo 6.0軟件設計并合成針對O1群和O139群特異性rfb和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）的PCR引物和探針（見表1）。

表1 實時熒光PCR所用引物和探針Table 1 Primers and probes for real－time fluorecent PCR assay

1.3 靈敏度實驗

將N16961、O22和MO45標準菌株于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，測OD600nm值估計細菌數(shù)，將菌液倍比稀釋到10－7，取10－4、10－5、10－6、10－7菌液進行平板計數(shù)，各稀釋度重復3個，按照相應的方法培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)取平均值確定其真實的菌密度。同時每個稀釋液各取1mL菌液于2mL離心管中并作3管重復，用于提取DNA測其OD260nm／OD280nm值并進行實時熒光PCR檢測，確定反應體系的靈敏度。

1.4 單重實時熒光PCR反應條件

實時熒光PCR采用20μL反應體系，每個反應中含10μL通用 PCR 反應預混液（TaqMan Gene Expression Master Mix（2×），ABI 產 品）；引 物 對（10μmol／L）各0.4μL、探針（10μmol／L）0.2μL、滅菌蒸餾水7μL、模板2μL。反應條件為第一步：預變性，進行1個循環(huán)：95℃10min；第二步：PCR反應 共40個循環(huán)，95℃15s；60℃1min。

1.5 三重實時熒光PCR反應條件

實時熒光PCR采用20μL反應體系，每個反應中含10μL 通用 PCR 反應預混液（TaqMan Gene Expression Master Mix（2×），ABI產 品）、O1 引 物 對（20μmol／L）各 0.25 μL、O1 探 針 （20 μmol／L）0.125μL、O139引物對（20μmol／L）各1μL、O139探針（20μmol／L）0.5μL 、hlyA 引物對（20μmol／L）各0.5μL、hlyA 探針（20μmol／L）0.4μL、滅菌蒸餾水3.15μL、模板2μL。反應條件為第一步：預變性，進行1個循環(huán)：95℃10min；第二步：PCR反應 共40個循環(huán)，95℃15s；60℃1min。

1.6 河口水標本的檢測和霍亂弧菌的分離

2007年3月～2008年6月間，對丹東市區(qū)的鴨綠江河段及其入海口處，采集水體標本共計252份。每份采集450mL，回實驗室后加入50mL 10倍濃縮的堿性蛋白胨增菌液，置37℃增菌6h，取其中1mL提取細菌DNA（ABI公司）做模板，按實時熒光PCR反應條件檢測O1、O139、非O1和非O139群霍亂弧菌，另分別取10μL涂TCBS平板分離霍亂弧菌，對生長的可疑菌落進行O1群及O139群霍亂診斷血清玻片凝集試驗和霍亂弧菌生化試驗。

2 結果與分析

2.1 靈敏度分析

采用 N16961（O1 群；1.9×107cfu／mL）、MO45（O139群；2.2×107cfu／mL）、O22（非O1／O139群；1.7×107cfu／mL）進行靈敏度和定量實驗研究，實時熒光PCR可檢測出至10－6，對應的菌落數(shù)分別為19cfu／mL、22cfu／mL和 17cfu／mL。定量關系式分別為：y＝－3.122 9 x＋37.814，R2＝0.998 8；y＝－3.206 6 x＋41.526，R2＝0.995；y＝ －3.657 7 x＋40.882，R2＝0.996 6。式中x分別表示O1群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)、O139群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)和O22霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)，y表示CT值。靈敏度實驗結果和定量實驗結果見圖1～3。

圖3 O22群霍亂弧菌定量實驗結果Fig.3 Quantity amplified curve for Vibrio cholerae O22serogroups assay

2.2 特異性分析

用建立的實時熒光PCR分別檢測不同年代分離、不同型別的霍亂弧菌DNA（31株O1群、27株非O1／O139群和5株O139群）以及其它水體中能分離出的8種常見弧菌。分別進行單重實時熒光PCR反應檢測O1群、O139群霍亂弧菌和所有血清型的霍亂弧菌，均表現(xiàn)出了100%的特異性。當模板中同時存在O1群、非O1／O139群和O139群DNA時，采用三重實時熒光PCR法時3種目的片段均獲得擴增（見圖4），并且結果互不干擾，并且能夠與其它弧菌和細菌相區(qū)別。說明O1群、O139群特異性rfb基因和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）共同檢測時特異性高，沒有交叉反應和干擾現(xiàn)象。

圖4 霍亂弧菌三重實時熒光PCR反應特異性實驗擴增曲線Fig.4 Specific amplified curve for Vibrio cholerae three multiplex Real－Time Fluorescent PCR

2.3 水體標本的檢測

本研究在丹東市鴨綠江水體的市區(qū)河段以及入?？谔幉杉怂w進行霍亂弧菌的監(jiān)測，對252份水體樣本進行霍亂弧菌的增菌后分離，同時用建立的O1群、非O1／O139群和O139群霍亂弧菌三重實時熒光PCR檢測增菌液DNA。常規(guī)分離菌株份數(shù)為14份O1群、149份非O1／O139群和2份O139群，而利用實時熒光PCR檢測，陽性份數(shù)為29份O1群、165份非O1／O139群和6份O139群。其中，所有常規(guī)分離方法陽性的標本，其實時PCR檢測也均為陽性，同時血清群檢測結果也一致。

表2 三重實時熒光PCR對水體標本中霍亂弧菌的檢測Table 2 Vibrio cholerae detected by three multiplex Real－Time Fluorescent PCR in Water samples

3 討論

熒光定量PCR已被應用于檢測水體環(huán)境中的霍亂弧 菌 等 病 原 菌［15－17］，Lyon 等［14］采 用 溶 血 素 基 因（hlyA）做探針，使用TaqMan PCR法檢測O1群、O139群以及非O1群和非O139群霍亂弧菌，獲得較高的靈敏度。本研究建立了基于熒光探針的實時熒光PCR法，用于水體增菌標本中快速檢測O1群、O139群、非O1和非O139群霍亂弧菌的方法，檢測的目標基因是O1群和O139群霍亂弧菌的O抗原特異的rfb基因片段和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）為靶序列，如果擴增出hlyA基因片段而未檢出O1群和O139群霍亂弧菌，則可認為檢出非O1和非O139群霍亂弧菌。實時熒光PCR法具有高特異性和高靈敏度并且快速可用于水體中霍亂弧菌的篩選。

本研究顯示，對標本第一次增菌液使用商品化試劑盒提取DNA標本，對于一份樣品，從DNA提取到實時熒光PCR檢測時間在2h以內，由于不需要對擴增產物的凝膠電泳分離，因此縮短了對樣品的檢測周期。另外實時熒光PCR比分離培養(yǎng)有明顯的高靈敏性，因此在處理標本時，可以先進行實時熒光PCR檢測，然后僅對陽性標本的增菌液進行后續(xù)分離鑒定，這樣能夠明顯增加監(jiān)測工作中處理的標本量，從而明顯提高監(jiān)測工作的靈敏性和工作效率。需注意的是水體中常能檢測到霍亂弧菌，但在非流行期，環(huán)境中常能檢到非產毒的霍亂弧菌，這類菌株有報道能引起輕微的腹瀉。

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