錢丹華，王 巍，蔣克海

白花蛇舌草注射液由天然地道藥材精制而成，具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕之功效。用于溫?zé)崽N(yùn)毒所致的呼吸道感染，扁桃體炎、肺炎、膽囊炎、闌尾炎、癰疥膿腫及手術(shù)后感染，亦可用于癌癥輔助治療。根據(jù)藥典要求，本品需接受無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證。通過對白花蛇舌草醇提物進(jìn)行了大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，白花蛇舌草對3種細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[1]。無菌檢驗(yàn)方法的主要目的在于對試驗(yàn)樣品在特定實(shí)驗(yàn)條件下是否具有抑菌活性，具有抗菌活性的注射劑進(jìn)行無菌檢查時必須選擇適宜的方法消除其抗菌作用，才能保證檢查結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性[2-3]。

1 材料與儀器

1.1 材料 (1)樣品:白花蛇舌草注射液，規(guī)格:2 ml/支;批號:110428 110526 110603;生產(chǎn)單位:安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司。(2)培養(yǎng)基:硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂(均由北京三藥科技開發(fā)公司提供)。(3)驗(yàn)證菌種:①金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];②枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];③大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];④生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941];⑤白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];⑥黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。(4)試液[4]:稀釋液:PH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液;沖洗液:0.1%蛋白胨緩沖液以上經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、薄膜過濾器 、HTY-2000集菌儀、全封閉集菌培養(yǎng)器、電熱鼓風(fēng)干燥箱 、壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h。取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至約10－7。取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－7，混勻備用。白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h。取經(jīng)26℃培養(yǎng)72 h的白色念珠菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，取1 ml加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－5，取1 ml加生理鹽水9 ml，混勻備用。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)5～7 d，使大量的孢子成熟。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4 ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，稀釋至10－4，取0.5 ml加生理鹽水10 ml混勻備用。

2.2 菌液計數(shù) 分別取上述5種細(xì)菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入營養(yǎng)瓊脂約18 ml。35℃培養(yǎng)(生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng))。分別取上述2種真菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入玫瑰紅鈉瓊脂約18 ml。26℃培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～表2。

表1 細(xì)菌數(shù)計數(shù)

表2 真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果

2.3 供試液的制備 按2010版中國藥典[4]規(guī)定，直接取樣。

2.4 培養(yǎng)基的適用性檢查[5]無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。無菌性檢查:每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14 d，結(jié)果:無菌生長。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按2010版《中國藥典》的無菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法[4]。

2.5.1 試驗(yàn)組 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次100 ml/桶，在最后1次的沖洗液中加入少于100 CFU的試驗(yàn)菌，過濾。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d。每天觀察并記錄結(jié)果。

2.5.2 陽性對照組 另取濾筒，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及改良馬丁培養(yǎng)基2桶，100 ml/桶。每天觀察并記錄結(jié)果

2.5.3 陰性對照組 2個濾器桶內(nèi)各過濾0.1%蛋白胨水200 ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml，不加對照菌液，分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

2.5.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結(jié)果。

2.5.5 結(jié)果判斷 與對照組比較，所含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，供試菌中大腸埃希菌生長緩慢，抑菌效果明顯，選為陽性對照菌。見表3～表4。

表3 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(24 h觀察)

表4 真菌結(jié)果(48 h觀察)

3 供試品的無菌檢查

3.1 試驗(yàn)組 薄膜過濾法:將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次100 ml/桶，在最后1次的沖洗液中逐一加入試驗(yàn)菌少于100 CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。每天觀察并記錄結(jié)果。

3.2 陽性對照 大腸埃希菌菌液制備:取經(jīng)36℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－5，混勻備用。取2瓶樣品，薄膜過濾后沖洗，最后1次沖洗前加入菌液(10－5)1 ml。加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100 ml。

3.3 陰性對照 2個濾器桶內(nèi)各過濾0.1%蛋白胨水200 ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml，不加對照菌液，分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

3.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結(jié)果。

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過試驗(yàn)可以得出白花蛇舌草注射液采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查[6]，該品種采用取樣量20支，沖洗液為0.1%蛋白胨緩沖液，沖洗量200 ml/桶的檢驗(yàn)條件消除抑菌性，其抑菌作用可忽略不計，陽性對照菌選用大腸埃希菌。見表5。

表5 大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(大腸埃希菌菌數(shù)82CFU)

4 討論

無菌檢查的目的是既要保證所有陽性對照菌正常生長，又要準(zhǔn)確無誤地檢查染菌情況。藥品無菌檢查準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵是試驗(yàn)中對其抑菌性的有效消除，驗(yàn)證菌株的沖洗量差異會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而應(yīng)選擇大沖洗量，以免漏檢。有實(shí)驗(yàn)[7]表明濃度降低和加大沖洗量殘留影響不大。增加沖洗量可減少供試品抑菌活性的干擾，如樣品管的微生物生長良好，則該檢驗(yàn)量已去除其抑菌作用;如樣品管的微生物生長微弱、緩慢或不生長，則該檢驗(yàn)量仍有抑菌作用，需消除。在增加沖洗次數(shù)時，每片膜的沖洗量一般不超過1 000 ml。否則，需驗(yàn)證加大沖洗量對濾膜質(zhì)量無影響，并選擇對樣品吸附作用較低的濾膜。

通過對本品沖洗液沖洗量(100，200 ml)的考察，表明白花蛇舌草注射液對大腸埃希菌最為敏感，沖洗量為200 ml/桶，可以消除樣品的抑菌活性，使6株試驗(yàn)菌均可正常生長，本樣品可以采用薄膜過濾法經(jīng)0.1% 蛋白胨緩沖液沖洗200 ml(總沖洗量)，此方法用于白花蛇舌草注射液的無菌檢查是可行的。通過無菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證能夠全面掌握測定方法和能夠準(zhǔn)確檢測方法的有效性，能夠全面適用于該供試品的檢驗(yàn)，避免產(chǎn)生假陰性和假陽性，更有利于對藥品質(zhì)量的控制保證藥品安全[8]。

[1]陳秀珍，朱大誠，王艷輝.白花蛇舌草藥理作用及臨床應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中藥材，2009，32(1):157-161.

[2]廖榮壽.克林霉素磷酸酯注射液無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué)，2011，23(1):56-57.

[3]李貞順，韓映晨.無菌檢驗(yàn)方法在藥品生產(chǎn)企業(yè)中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5(19):137-138.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010，(1)，76-79.

[5]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:華齡出版社，2007:209-273.

[6]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[S].2010.

[7]莫慧珍，許則省.注射用鹽酸克林霉素的無菌檢查方法驗(yàn)證[J].今日藥學(xué)，2006，19(6):39-42.

[8]陳萬勝.淺淡藥品生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2011 ，6(3):245.