錢丹華，王 巍，蔣克海

白花蛇舌草注射液由天然地道藥材精制而成，具有清熱解毒、消痛散結、利尿除濕之功效。用于溫熱蘊毒所致的呼吸道感染，扁桃體炎、肺炎、膽囊炎、闌尾炎、癰疥膿腫及手術后感染，亦可用于癌癥輔助治療。根據(jù)藥典要求，本品需接受無菌檢查方法學驗證。通過對白花蛇舌草醇提物進行了大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的敏感性實驗，結果表明，白花蛇舌草對3種細菌表現(xiàn)出較強的抑菌活性[1]。無菌檢驗方法的主要目的在于對試驗樣品在特定實驗條件下是否具有抑菌活性，具有抗菌活性的注射劑進行無菌檢查時必須選擇適宜的方法消除其抗菌作用，才能保證檢查結果準確性和可靠性[2-3]。

1 材料與儀器

1.1 材料 (1)樣品:白花蛇舌草注射液，規(guī)格:2 ml/支;批號:110428 110526 110603;生產單位:安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司。(2)培養(yǎng)基:硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂(均由北京三藥科技開發(fā)公司提供)。(3)驗證菌種:①金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];②枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];③大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];④生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941];⑤白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];⑥黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。(4)試液[4]:稀釋液:PH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液;沖洗液:0.1%蛋白胨緩沖液以上經121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、薄膜過濾器 、HTY-2000集菌儀、全封閉集菌培養(yǎng)器、電熱鼓風干燥箱 、壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h。取經35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至約10－7。取經35℃培養(yǎng)24 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－7，混勻備用。白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h。取經26℃培養(yǎng)72 h的白色念珠菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，取1 ml加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－5，取1 ml加生理鹽水9 ml，混勻備用。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)5～7 d，使大量的孢子成熟。取經25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4 ml洗下孢子，吸出轉移至空試管作為原液，稀釋至10－4，取0.5 ml加生理鹽水10 ml混勻備用。

2.2 菌液計數(shù) 分別取上述5種細菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入營養(yǎng)瓊脂約18 ml。35℃培養(yǎng)(生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng))。分別取上述2種真菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入玫瑰紅鈉瓊脂約18 ml。26℃培養(yǎng)。實驗結果見表1～表2。

表1 細菌數(shù)計數(shù)

表2 真菌數(shù)計數(shù)結果

2.3 供試液的制備 按2010版中國藥典[4]規(guī)定，直接取樣。

2.4 培養(yǎng)基的適用性檢查[5]無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。無菌性檢查:每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14 d，結果:無菌生長。

2.5 驗證實驗 按2010版《中國藥典》的無菌檢查的驗證實驗方法[4]。

2.5.1 試驗組 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次100 ml/桶，在最后1次的沖洗液中加入少于100 CFU的試驗菌，過濾。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d。每天觀察并記錄結果。

2.5.2 陽性對照組 另取濾筒，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，各試驗菌及相應的培養(yǎng)基逐一進行驗證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及改良馬丁培養(yǎng)基2桶，100 ml/桶。每天觀察并記錄結果

2.5.3 陰性對照組 2個濾器桶內各過濾0.1%蛋白胨水200 ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml，不加對照菌液，分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

2.5.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結果。

2.5.5 結果判斷 與對照組比較，所含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。由實驗結果可知，供試菌中大腸埃希菌生長緩慢，抑菌效果明顯，選為陽性對照菌。見表3～表4。

表3 細菌實驗結果(24 h觀察)

表4 真菌結果(48 h觀察)

3 供試品的無菌檢查

3.1 試驗組 薄膜過濾法:將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次100 ml/桶，在最后1次的沖洗液中逐一加入試驗菌少于100 CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內。每天觀察并記錄結果。

3.2 陽性對照 大腸埃希菌菌液制備:取經36℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml生理鹽水，10倍稀釋至10－5，混勻備用。取2瓶樣品，薄膜過濾后沖洗，最后1次沖洗前加入菌液(10－5)1 ml。加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100 ml。

3.3 陰性對照 2個濾器桶內各過濾0.1%蛋白胨水200 ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml，不加對照菌液，分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

3.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結果。

3.5 實驗結果 通過試驗可以得出白花蛇舌草注射液采用薄膜過濾法進行無菌檢查[6]，該品種采用取樣量20支，沖洗液為0.1%蛋白胨緩沖液，沖洗量200 ml/桶的檢驗條件消除抑菌性，其抑菌作用可忽略不計，陽性對照菌選用大腸埃希菌。見表5。

表5 大腸埃希菌實驗結果(大腸埃希菌菌數(shù)82CFU)

4 討論

無菌檢查的目的是既要保證所有陽性對照菌正常生長，又要準確無誤地檢查染菌情況。藥品無菌檢查準確與否的關鍵是試驗中對其抑菌性的有效消除，驗證菌株的沖洗量差異會影響實驗結果，因而應選擇大沖洗量，以免漏檢。有實驗[7]表明濃度降低和加大沖洗量殘留影響不大。增加沖洗量可減少供試品抑菌活性的干擾，如樣品管的微生物生長良好，則該檢驗量已去除其抑菌作用;如樣品管的微生物生長微弱、緩慢或不生長，則該檢驗量仍有抑菌作用，需消除。在增加沖洗次數(shù)時，每片膜的沖洗量一般不超過1 000 ml。否則，需驗證加大沖洗量對濾膜質量無影響，并選擇對樣品吸附作用較低的濾膜。

通過對本品沖洗液沖洗量(100，200 ml)的考察，表明白花蛇舌草注射液對大腸埃希菌最為敏感，沖洗量為200 ml/桶，可以消除樣品的抑菌活性，使6株試驗菌均可正常生長，本樣品可以采用薄膜過濾法經0.1% 蛋白胨緩沖液沖洗200 ml(總沖洗量)，此方法用于白花蛇舌草注射液的無菌檢查是可行的。通過無菌檢驗方法驗證能夠全面掌握測定方法和能夠準確檢測方法的有效性，能夠全面適用于該供試品的檢驗，避免產生假陰性和假陽性，更有利于對藥品質量的控制保證藥品安全[8]。

[1]陳秀珍，朱大誠，王艷輝.白花蛇舌草藥理作用及臨床應用研究新進展[J].中藥材，2009，32(1):157-161.

[2]廖榮壽.克林霉素磷酸酯注射液無菌檢查方法學驗證[J].海峽藥學，2011，23(1):56-57.

[3]李貞順，韓映晨.無菌檢驗方法在藥品生產企業(yè)中的應用[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2011，5(19):137-138.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010，(1)，76-79.

[5]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社，2007:209-273.

[6]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品標準操作規(guī)程[S].2010.

[7]莫慧珍，許則省.注射用鹽酸克林霉素的無菌檢查方法驗證[J].今日藥學，2006，19(6):39-42.

[8]陳萬勝.淺淡藥品生產企業(yè)無菌檢驗方法驗證[J].中國實用醫(yī)藥，2011 ，6(3):245.