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        白花蛇舌草注射液無菌檢查方法驗(yàn)證

        2013-10-15 06:52:50錢丹華蔣克海
        淮海醫(yī)藥 2013年1期
        關(guān)鍵詞:白花蛇舌草酸鹽

        錢丹華,王 巍,蔣克海

        白花蛇舌草注射液由天然地道藥材精制而成,具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕之功效。用于溫?zé)崽N(yùn)毒所致的呼吸道感染,扁桃體炎、肺炎、膽囊炎、闌尾炎、癰疥膿腫及手術(shù)后感染,亦可用于癌癥輔助治療。根據(jù)藥典要求,本品需接受無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證。通過對白花蛇舌草醇提物進(jìn)行了大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的敏感性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,白花蛇舌草對3種細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[1]。無菌檢驗(yàn)方法的主要目的在于對試驗(yàn)樣品在特定實(shí)驗(yàn)條件下是否具有抑菌活性,具有抗菌活性的注射劑進(jìn)行無菌檢查時必須選擇適宜的方法消除其抗菌作用,才能保證檢查結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性[2-3]。

        1 材料與儀器

        1.1 材料 (1)樣品:白花蛇舌草注射液,規(guī)格:2 ml/支;批號:110428 110526 110603;生產(chǎn)單位:安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司。(2)培養(yǎng)基:硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂(均由北京三藥科技開發(fā)公司提供)。(3)驗(yàn)證菌種:①金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];②枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];③大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];④生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941];⑤白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];⑥黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。(4)試液[4]:稀釋液:PH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液;沖洗液:0.1%蛋白胨緩沖液以上經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

        1.2 儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、薄膜過濾器 、HTY-2000集菌儀、全封閉集菌培養(yǎng)器、電熱鼓風(fēng)干燥箱 、壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)24 h。取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 ml,加9 ml生理鹽水,10倍稀釋至約10-7。取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 ml,加9 ml生理鹽水,10倍稀釋至10-7,混勻備用。白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)48 h。取經(jīng)26℃培養(yǎng)72 h的白色念珠菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物,取1 ml加9 ml生理鹽水,10倍稀釋至10-5,取1 ml加生理鹽水9 ml,混勻備用。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,26℃培養(yǎng)5~7 d,使大量的孢子成熟。取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物,加入生理鹽水4 ml洗下孢子,吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液,稀釋至10-4,取0.5 ml加生理鹽水10 ml混勻備用。

        2.2 菌液計數(shù) 分別取上述5種細(xì)菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿,每種菌液做平行2皿。注入營養(yǎng)瓊脂約18 ml。35℃培養(yǎng)(生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng))。分別取上述2種真菌菌液1 ml加入培養(yǎng)皿,每種菌液做平行2皿。注入玫瑰紅鈉瓊脂約18 ml。26℃培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1~表2。

        表1 細(xì)菌數(shù)計數(shù)

        表2 真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果

        2.3 供試液的制備 按2010版中國藥典[4]規(guī)定,直接取樣。

        2.4 培養(yǎng)基的適用性檢查[5]無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。無菌性檢查:每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶),培養(yǎng)14 d,結(jié)果:無菌生長。

        2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按2010版《中國藥典》的無菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法[4]。

        2.5.1 試驗(yàn)組 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾,沖洗,每次100 ml/桶,在最后1次的沖洗液中加入少于100 CFU的試驗(yàn)菌,過濾。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3~5 d。每天觀察并記錄結(jié)果。

        2.5.2 陽性對照組 另取濾筒,不過濾供試品,其它操作同上,作為陽性對照,將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3~5 d,各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及改良馬丁培養(yǎng)基2桶,100 ml/桶。每天觀察并記錄結(jié)果

        2.5.3 陰性對照組 2個濾器桶內(nèi)各過濾0.1%蛋白胨水200 ml,然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml,不加對照菌液,分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

        2.5.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結(jié)果。

        2.5.5 結(jié)果判斷 與對照組比較,所含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好,說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計,照此檢查方法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,供試菌中大腸埃希菌生長緩慢,抑菌效果明顯,選為陽性對照菌。見表3~表4。

        表3 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(24 h觀察)

        表4 真菌結(jié)果(48 h觀察)

        3 供試品的無菌檢查

        3.1 試驗(yàn)組 薄膜過濾法:將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾,沖洗,每次100 ml/桶,在最后1次的沖洗液中逐一加入試驗(yàn)菌少于100 CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。每天觀察并記錄結(jié)果。

        3.2 陽性對照 大腸埃希菌菌液制備:取經(jīng)36℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml,加9 ml生理鹽水,10倍稀釋至10-5,混勻備用。取2瓶樣品,薄膜過濾后沖洗,最后1次沖洗前加入菌液(10-5)1 ml。加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100 ml。

        3.3 陰性對照 2個濾器桶內(nèi)各過濾0.1%蛋白胨水200 ml,然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100 ml,不加對照菌液,分別于35℃及26℃培養(yǎng)。

        3.4 培養(yǎng) 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管35℃培養(yǎng);改良馬丁培養(yǎng)基管26℃培養(yǎng)。觀察結(jié)果。

        3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過試驗(yàn)可以得出白花蛇舌草注射液采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查[6],該品種采用取樣量20支,沖洗液為0.1%蛋白胨緩沖液,沖洗量200 ml/桶的檢驗(yàn)條件消除抑菌性,其抑菌作用可忽略不計,陽性對照菌選用大腸埃希菌。見表5。

        表5 大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(大腸埃希菌菌數(shù)82CFU)

        4 討論

        無菌檢查的目的是既要保證所有陽性對照菌正常生長,又要準(zhǔn)確無誤地檢查染菌情況。藥品無菌檢查準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵是試驗(yàn)中對其抑菌性的有效消除,驗(yàn)證菌株的沖洗量差異會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因而應(yīng)選擇大沖洗量,以免漏檢。有實(shí)驗(yàn)[7]表明濃度降低和加大沖洗量殘留影響不大。增加沖洗量可減少供試品抑菌活性的干擾,如樣品管的微生物生長良好,則該檢驗(yàn)量已去除其抑菌作用;如樣品管的微生物生長微弱、緩慢或不生長,則該檢驗(yàn)量仍有抑菌作用,需消除。在增加沖洗次數(shù)時,每片膜的沖洗量一般不超過1 000 ml。否則,需驗(yàn)證加大沖洗量對濾膜質(zhì)量無影響,并選擇對樣品吸附作用較低的濾膜。

        通過對本品沖洗液沖洗量(100,200 ml)的考察,表明白花蛇舌草注射液對大腸埃希菌最為敏感,沖洗量為200 ml/桶,可以消除樣品的抑菌活性,使6株試驗(yàn)菌均可正常生長,本樣品可以采用薄膜過濾法經(jīng)0.1% 蛋白胨緩沖液沖洗200 ml(總沖洗量),此方法用于白花蛇舌草注射液的無菌檢查是可行的。通過無菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證能夠全面掌握測定方法和能夠準(zhǔn)確檢測方法的有效性,能夠全面適用于該供試品的檢驗(yàn),避免產(chǎn)生假陰性和假陽性,更有利于對藥品質(zhì)量的控制保證藥品安全[8]。

        [1]陳秀珍,朱大誠,王艷輝.白花蛇舌草藥理作用及臨床應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中藥材,2009,32(1):157-161.

        [2]廖榮壽.克林霉素磷酸酯注射液無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].海峽藥學(xué),2011,23(1):56-57.

        [3]李貞順,韓映晨.無菌檢驗(yàn)方法在藥品生產(chǎn)企業(yè)中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2011,5(19):137-138.

        [4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010,(1),76-79.

        [5]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:華齡出版社,2007:209-273.

        [6]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[S].2010.

        [7]莫慧珍,許則省.注射用鹽酸克林霉素的無菌檢查方法驗(yàn)證[J].今日藥學(xué),2006,19(6):39-42.

        [8]陳萬勝.淺淡藥品生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2011 ,6(3):245.

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