黃 霞，謝瑞敏，嚴 峰

（海南大學 海洋學院，海南 海口 570228）

自從于1940年發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）后，經(jīng)過半個多世紀的不斷認識和探究，現(xiàn)已初步了解其作用機制.FGFs是由23個成員組成的蛋白質(zhì)家族（FGFl～FGF23[1]）.酸性成纖維細胞生長因子（acid fibroblast growth factor，aFGF），即FGF1，大量存在于腎臟和腦組織中[2].aFGF的生理功能和生物學效應(yīng)豐富多樣，尤其在促進機體的生長發(fā)育、修復(fù)組織的損傷等方面發(fā)揮重要作用.研究表明，aFGF具有促進腫瘤細胞增殖的作用，在腫瘤組織的細胞表面表達豐富，和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系[3-9].所以，我們可以從篩選aFGF拮抗肽入手，為腫瘤治療提供新的途徑.

噬菌體展示技術(shù)（phage display technology，PDT）是在1985年由Smith[10]創(chuàng)建，在逐步完善的基礎(chǔ)上，因為其高效、簡便的優(yōu)勢而被廣泛運用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域.它是通過將靶標蛋白包被固相載體后，從噬菌體肽庫中篩選出特異性結(jié)合的短肽，并通過測序和合成用于新藥研究.由于FGFs具有廣闊的應(yīng)用前景，為了得到其有效的抑制短肽，噬菌體展示技術(shù)提供了新的途徑.其中，F(xiàn)an等[11]用噬菌體15肽庫，以固相包被的aFGF為靶標，篩選得到的15肽，其中的SSG和VPS基序與FGFR1相同.經(jīng)一系列實驗證明，其能夠有效的抑制aFGF促進細胞的增殖.而用噬菌體7肽庫篩選，與15肽庫篩選相比較，具有：特異性更高、空間位阻更小、體內(nèi)穩(wěn)定性高、穿透腫瘤組織的能力強以及免疫源性低的優(yōu)點.因此，我們用噬菌體7肽庫，以固相包被的aFGF為靶標，篩選aFGF的結(jié)合肽，并進行了初步的研究鑒定，可為抗腫瘤新藥提供重要基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

噬菌體七肽庫（Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library）、E.coli ER2738均購自New England BioLabs公司.噬菌體篩選和擴增以及滴度測定、基因組的抽提參考NEB使用手冊.HRP-抗M13抗體為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品.輔助噬菌體vcsM13購自Biovector.人aFGF購自Sigma公司，Balb/c 3T3細胞株由本研究室保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 aFGF結(jié)合肽的篩選

將aFGF用0.1 mol/L pH 8.6的NaHCO3溶液稀釋后，包被96孔酶標板，4℃輕微震蕩，孵育過夜.次日，倒掉板中的包被液，加滿封阻液，4℃作用2 h.再用TBST（TBS+0.1%[v/v]Tween-20）緩沖液快速洗板6次.加入用TBST稀釋的原始噬菌體肽庫結(jié)合2 h后用TBST洗板10次.再用非特異性緩沖液Glycine-HCl洗脫 10 min，用 1 mol/L Tris-HCl（pH 9.1）中和洗脫液.取1 μL測滴度，剩的洗脫液全部擴增用于下一輪篩選.每輪逐步減少aFGF的包被量和結(jié)合時間、提高吐溫濃度以及洗板時間，重復(fù)4輪淘選.

1.2.2 鑒定aFGF特異性結(jié)合噬菌體克隆及測序

將aFGF用NaHCO3溶液稀釋后，包被96孔酶標板過夜.次日，倒去包被液，封閉液封閉2 h.用1×TBS/Tween洗板6次，Tween濃度與第四輪篩選步驟中所用濃度相同.加入噬菌體孵育，TBST洗脫后加入HRP-抗M13抗體，孵育1 h，TMB避光顯色，H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀（318-MC型，上海高科技儀器有限公司）450 nm測OD值，空白對照.挑取陽性克隆，按照NEB使用手冊進行擴增.以5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'為測序引物，送華大基因公司測序.

1.2.3 aFGF競爭抑制實驗

用aFGF稀釋液包被96孔酶標板，4℃過夜.次日去包被液加封閉液，4℃靜置封閉l h后TBST洗脫.將aFGF依次稀釋為40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL-1，然后與陽性噬菌體克隆室溫孵育.再將二者結(jié)合液加到96孔板中競爭結(jié)合.每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以野生型vcsM13噬菌體做對照.TBST洗脫后加入HRP-抗M13抗體，孵育1 h，TMB避光顯色，H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀450 nm測OD值.

1.2.4 先導(dǎo)肽對aFGF誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞增值的影響

在96孔酶標板中按每孔6000個細胞的密度加入Balb/c 3T3細胞，24 h后加入150 μL含0.4%血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5%CO2饑餓培養(yǎng)24 h.將稀釋的陽性噬菌體與aFGF混合物加入，每種樣品設(shè)4個稀釋度各3個復(fù)孔.以vcsM13噬菌體做對照.繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20 μl MTT，再培養(yǎng)4 h.加入DMSO終止反應(yīng)，30 min后，570 nm測OD值.

2 結(jié)果

2.1 特異性噬菌體的篩選與富集

通過四輪篩選，與aFGF結(jié)合的噬菌體每一輪的回收率都在逐步提高，P/N值第四輪達到了93，表明四輪篩選的特異性都非常高.通過四輪篩選，特異性的噬菌體已經(jīng)得到了有效的富集（見表1）.

表1 四輪親和淘選中噬菌體的富集Tab.1 The enrichment of phages in four rounds of biopanning

2.2 aFGF特異性結(jié)合噬菌體的初步鑒定

根據(jù)Takayasu[12]等在2010年發(fā)表于BBB雜志上的文獻作參考，將四輪篩選出的噬菌體做ELISA對照實驗，結(jié)果見圖1.

可以看出，每一輪篩選的特異性都在逐步提高，說明特異性噬菌體的富集效果很好.從少于～100個藍斑的平皿上隨機挑選24個分隔良好的單克隆做ELISA實驗，可以得出2、7、8、20、21號的OD值與對照組相比有顯著差異，其中8號噬菌體（P8）的特異性最顯著.見圖2.

2.3 aFGF結(jié)合肽的測序

將挑取的24個噬菌體單克隆擴增提DNA后，送華大基因公司測序，其中得出P8的展示短肽序列為AHVPSRS，與FGFR1中“—V220PSdkgnyt C229—”含有相同的基序.

圖1 四輪篩選的噬菌體液ELISAFig.1 ELISA of phage mixture after fourth round

2.4 aFGF的競爭抑制實驗

將P8噬菌體預(yù)先與aFGF充分結(jié)合，然后將混合物加到aFGF包被的96孔酶標板中.以兩種不同作用形式的aFGF來競爭結(jié)合P8噬菌體，以此檢測P8噬菌體與aFGF結(jié)合的特異性（見圖3）.可以看出，隨著游離aFGF濃度的逐步降低，對固相包被的aFGF與P8噬菌體結(jié)合的抑制作用亦隨之降低，而野生型vcsM13噬菌體的抑制作用無明顯變化.可以得出，篩選得到的P8噬菌體具有與aFGF高度結(jié)合的能力.

2.5 P8先導(dǎo)肽對aFGF誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞增殖的影響

通過MTT實驗，可看出p8噬菌體對aFGF誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞增殖有明顯的抑制作用（見圖4）.隨著噬菌體的濃度增高，細胞增殖的抑制效果也隨之增高，抑制率高達73%，而野生型vcsM13噬菌體的影響作用卻無明顯變化.

圖2 ELISA分析噬菌體陽性克隆與aFGF的結(jié)合能力Fig.2 The binding ability of the positive phage clones to aFGF analyzed by ELISA

圖3 游離aFGF對P8噬菌體與固定化aFGF結(jié)合的競爭抑制作用Fig.3 Competitive inhibition of P8 phage binding to the immobilized aFGF by free aFGF

圖4 P8噬菌體對aFGF誘導(dǎo)的Balb/c 3T3細胞增殖的影響Fig.4 Efects of P8 phage on Balb/c 3T3 cell proliferation induced by aFGF

3 討論

噬菌體展示技術(shù)是一項篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi).使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，從而使各種靶分子（抗體、酶、細胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定[13].而噬菌體7肽庫的特點是將外源7肽表達于pⅢ蛋白的N末端，而C端連接G-G-G-S多肽.以pⅢ融合子方式表達的多肽是低價的，而以pⅧ融合子方式表達的多肽則是高價的.這種高價pⅧ展示所增加的親和力有利于篩選得到親和力非常低的配體，而低價pⅢ展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上.

用噬菌體肽庫進行篩選時，篩選的嚴謹性和產(chǎn)量的關(guān)系很重要.篩選嚴謹性的提高，能提高噬菌體的特異性，但產(chǎn)量會因此而降低；如果產(chǎn)量太高，則會得到許多特異性低的噬菌體.因此，本實驗通過改變不同的篩選條件來達到嚴謹性與產(chǎn)量的平衡：即減少每輪靶標蛋白包被量（15.0、10.0、5.0、2.5 μg）、減少每輪噬菌體與靶標蛋白的結(jié)合時間（2.0、1.5、1.0、0.5 h）、提高TBST中Tween-20的濃度（0.05%、0.10%、0.20%、0.40%），延長洗滌時間（1min/次、2min/次、3min/次、4min/次）.經(jīng)過嚴謹性逐步提高的四輪篩選，高特異性的噬菌體得到了有效的富集.

aFGF的作用方式是先結(jié)合肝素，再通過HSPG與受體FGFR的胞外結(jié)合域相連，通過激活受體胞質(zhì)部的酪氨酸自身磷酸化而引發(fā)信號通路發(fā)揮作用的，其中主要是與FGFR1相結(jié)合.本實驗所使用的Balb/c 3T3細胞則從Balb/c小鼠的胚胎成纖維細胞獲得，其細胞表面的受體FGFR1和FGFR2表達豐富.從實驗數(shù)據(jù)可以看出，與野生型噬菌體vcsM13相比，P8噬菌體能夠明顯的抑制aFGF對Balb/c 3T3細胞的增殖作用.這可以說明，篩選得到的P8噬菌體與aFGF結(jié)合后，抑制了其與受體FGFR1的結(jié)合.P8噬菌體不是通過其他表面蛋白與aFGF結(jié)合的，而是競爭性結(jié)合了aFGF與FGFR1結(jié)合的位點，阻斷了aFGF與受體FGFR1的結(jié)合，阻斷了FGFR1的信號通路，從而有效地抑制了aFGF對Balb/c 3T3細胞的促分裂作用.本實驗通過噬菌體展示技術(shù)，獲得了與aFGF具有高度特異性結(jié)合能力的7肽.在此基礎(chǔ)上，可對其具體的作用機制進一步研究，為下一步開發(fā)抗腫瘤新藥打下基礎(chǔ).

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