姜迎婭，龔聲輝，朱 麟

（海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158）

室內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境條件下飼養(yǎng)出來的寄生蜂釋放到野外多變的環(huán)境后，會對寄生蜂的生存造成很大的困難.經(jīng)調(diào)查，椰甲截脈姬小蜂的野外種群寄生率低、種群數(shù)量小、不能成功定殖是防治過程中的一大難題[4].那么，在野外環(huán)境條件下，椰甲截脈姬小蜂是否會產(chǎn)生適應(yīng)性，這是目前尚未涉及的問題.目前的研究主要是針對該蜂的生物學(xué)特性及基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)的研究，對該蜂體內(nèi)各種適應(yīng)性酶同工酶的研究還未見報道.

因此，為弄清這一問題，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群的過氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶進行了比較研究，確定其同工酶酶譜，以部分理解該蜂是否適應(yīng)了野外多變的環(huán)境條件，以期獲得室內(nèi)外種群在不同生存條件下的差異性證據(jù)，同時也為椰心葉甲的可持續(xù)生物防治提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 蟲源

椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群均由實驗室室內(nèi)飼養(yǎng)，種蜂由海南省儋州市森林植物防治檢疫站提供.飼養(yǎng)方法如下：將新鮮椰樹心葉與老葉裁剪為長短適中的長條，參雜混合，約30片為一捆，置于自主設(shè)計的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每個盒里放三捆，盒蓋中央覆蓋紗網(wǎng)以保證透氣及防止成蟲逃逸.每3d更換一次心葉，并用75%酒精擦拭消毒養(yǎng)蟲盒.飼養(yǎng)多代后挑選健康活躍的椰心葉甲2～4齡幼蟲，每盒200頭，將寄生蜂成蟲與椰心葉甲幼蟲按3∶1的數(shù)量接入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，并用10%蜂蜜水補充營養(yǎng)，將養(yǎng)蟲盒置于室內(nèi)溫度25～26℃，相對濕度75%～80%，L∶D=12h∶12h的條件下飼養(yǎng)[4]，7d后挑取被寄生的椰心葉甲僵蟲2～3頭裝入一管口有脫脂棉的指形管內(nèi)，在上述飼養(yǎng)過程的相同條件下讓寄生蜂羽化.羽化的成蟲立即置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?

椰甲截脈姬小蜂野外種群由如下方法獲得：將2011年5月至11月由?？谑?、儋州市、文昌市等地區(qū)采集到的椰心葉甲僵蟲帶回實驗室，每2～3頭裝入一管口有脫脂棉的指形管內(nèi)，將其放入與室內(nèi)種群相同的條件下發(fā)育，待成蟲羽化后立即將其置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 樣品制備

分別秤取椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群和野外種群各0.03 g，放入冰凍的研缽內(nèi)，加預(yù)冷的0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液1 mL和少許石英砂，冰浴迅速研磨，然后再以1 mL磷酸緩沖液分幾次洗入2 mL離心管.4℃下10000 rpm離心10min，取上清液重復(fù)離心一次后的上清液即為酶的粗提液.按每管30 μL分裝后將樣品置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 電泳及活性染色

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)方法[5]，膠厚約1mm，分離膠濃度為10%，pH8.9；濃縮膠濃度為4%，pH 6.8，電極緩沖液為Tris-Gly（pH8.3），上樣量約為20 μL.在4℃條件下進行電泳，采用恒壓60V電泳，當指示劑跑到濃縮膠與分離膠界線時，升壓至100V，繼續(xù)電泳，待指示劑遷移至凝膠底部時，停止電泳，電泳時間約為5～7h.電泳完畢后，過氧化物酶同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法染色，酯酶同工酶采用堅牢藍RR鹽染色法染色.染色完畢經(jīng)蒸餾水沖洗后于7%醋酸溶液中固定.

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化物酶同工酶酶譜的比較

椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)與野外種群POD同工酶電泳模式圖見圖1.按酶帶顏色深淺及寬窄可分為強帶、次強帶和弱帶.酶帶顏色的深淺代表酶活性，顏色越深，活性越強；酶帶寬窄代表酶的含量，酶帶越寬，酶含量越高[6].兩個種群共顯示5種遷移率不同的POD同工酶帶，遷移率在0.038～0.208之間，同一種酶帶的遷移率基本相同（見表1）.從陰極到陽極依次將酶帶編號為P1、P2、P3、P4、P5.

圖1 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶電泳模式圖Fig.1 Peroxidase isozyme schematic diagram of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

表1 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶酶帶相對遷移率Tab.1 Peroxidase isozyme mobility of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

由圖1可知，椰甲截脈姬小蜂兩個種群的POD同工酶酶帶可以分為兩個染色區(qū)段，第一區(qū)段包括遷移率為0.038和0.075的兩條酶帶，剩下3條同屬于第二區(qū)段.第一區(qū)段兩條酶帶的顏色比第二區(qū)段淺，而且窄，均為弱帶；第二區(qū)段的酶帶較強.兩個種群的酶譜存在較明顯的差異，野外種群有5條同工酶帶，比室內(nèi)種群多了一條遷移率為0.038的P1酶帶,其余4條酶帶為兩個種群共有，但野外種群酶帶的顏色普遍比室內(nèi)種群的深，表明其POD活性比室內(nèi)種群強.另外室內(nèi)種群的P2酶帶比野外種群的P2酶帶稍窄，表明此處野外種群的POD酶含量較室內(nèi)種群高.

2.2 酯酶同工酶酶譜的比較

經(jīng)多次重復(fù)試驗比較，其特征酶譜穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，說明以酯酶同工酶作為椰甲截脈姬小蜂的生化比較指標具有一定的可靠性.室內(nèi)外種群的EST同工酶電泳模式圖見圖2.其酶譜共顯示6種遷移率不同的EST同工酶酶帶，同一種酶帶的遷移率基本相同（見表2）.從陰極到陽極可將酶帶分為A、B、C、D四個染色區(qū)，依次將酶帶編號為A1、A2、B1、C1、C2、D1.

圖2 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群EST同工酶電泳模式圖Fig.2 Esterase isozyme schematic diagram of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

表2 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群EST同工酶酶帶相對遷移率Tab.2 Esterase isozyme mobility of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

由圖2可知，室內(nèi)種群共顯示5條酶帶，而野外種群有6條酶帶，A、B、C區(qū)兩種群均有分布且有相同的的遷移率，但每條酶帶的顏色深淺及寬窄存在差異.室內(nèi)、野外種群的酶帶A1寬窄與顏色深淺比較相似，均為極強帶，室內(nèi)種群相比于野外種群酶帶A2、C1、C2的顏色要稍許深些，分別為強帶、較弱帶、極強帶，而野外種群的分別為較強帶、弱帶、強帶.室內(nèi)種群相比于野外種群缺少D區(qū)Rf=0.58的D1酶帶.

3 討論

酶的變化可以反應(yīng)生物的多種適應(yīng)性變化.從實驗的結(jié)果來看，椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群與野外種群過氧化物酶及酯酶同工酶的酶譜存在較明顯的差異，說明該蜂為適應(yīng)野外的環(huán)境已經(jīng)發(fā)生了適應(yīng)性的變化.

楊秀芬等[7]在對異色瓢蟲10種色斑型的EST同工酶研究中表明，在不同生態(tài)環(huán)境下相同色斑型的異色瓢蟲酶譜不同.椰甲截脈姬小蜂在室內(nèi)和野外兩種不同的生態(tài)環(huán)境下，POD和EST酶譜均存在差異，但兩個種群的酶譜相似程度仍然比較高，因此，變化的程度仍需進一步詳細的研究.

生物的遺傳變異反映了生物群體內(nèi)多態(tài)等位基因的存在，是生物進化的先決條件，也是同工酶技術(shù)在研究生物分類及系統(tǒng)進化中得以應(yīng)用的理論基礎(chǔ)[8].同工酶作為基因表達的直接或間接產(chǎn)物，它們的豐富程度直接影響生物體的機能和對環(huán)境的適應(yīng)能力.同工酶多態(tài)性越高，越復(fù)雜，表明其遺傳多樣性越豐富，群體更能適應(yīng)環(huán)境[9].通過對椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶和EST同工酶酶譜的比較，可以看到野外種群比室內(nèi)種群的POD多一條Rf=0.038的酶帶，EST也多一條Rf=0.58的酶帶，這也許就是該蜂為適應(yīng)野外多變的環(huán)境微進化反應(yīng).

所有需氧生物的生理過程均有自由基的產(chǎn)生和消除，并且兩者存在動態(tài)平衡，如果失去平衡，便會對機體造成損傷引起病變[10].同樣，昆蟲也有一套由過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）等抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng)，用以減少氧化脅迫.有研究表明，昆蟲的保護酶系統(tǒng)與昆蟲的耐熱性有關(guān)[11].從本實驗結(jié)果來看，椰甲截脈姬小蜂野外種群POD活性比室內(nèi)種群強，其原因可能就是該蜂的野外種群采自海南的5月至11月，這段時間的溫度比室內(nèi)的25℃左右的溫度高，為了更好的適應(yīng)相對較高溫的環(huán)境，提高機體的耐熱性，增加POD的活性，有利于清除過氧化氫，平衡體內(nèi)的自由基.

孫蕊芬等[3]比較了椰甲截脈姬小蜂野外種群和室內(nèi)種群的雌雄比、出蜂量、未出蜂量、懷卵量的差異，表明野外種群和室內(nèi)種群已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的分化，室內(nèi)條件與野外條件確實能造成種群的分化.研究兩個種群的過氧化物酶和酯酶，為兩個種群的差異性提供了生化上的證據(jù).但結(jié)果是初步的.仍有許多復(fù)雜的適應(yīng)性問題需要進一步研究.現(xiàn)從生物學(xué)和生化的角度均證明，椰甲截脈姬小蜂釋放到野外后發(fā)生了適應(yīng)性的變化，如果能對這種變化加以人為的利用，建立起真正適應(yīng)野外生存的種群，對椰心葉甲的防治將具有十分重要的意義.

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