朱 劼，汪 云，李晨旸，符夢婷，王利群，何玉財

（常州大學制藥與生命科學學院，江蘇 常州 213164）

催化加氫，尤其對α,β-不飽和醛的選擇性催化加氫，是精細化學品合成工藝中一類非常重要的有機催化反應。由于其在香料化學[1]和藥物合成[2]上的廣泛應用，近年來，備受人們的關注。檸檬醛（citral）作為一種典型的α,β-不飽和醛，其分子結構中擁有3個加氫位點：碳氧雙鍵（C=O），與碳氧雙鍵共軛的碳碳雙鍵（C=C）以及孤立的碳碳雙鍵（C=C）。對檸檬醛進行加氫反應，隨加氫位置和加氫程度的不同，分別可得到不飽和醇、飽和醛、飽和醇或烷烴等產物[3-5]，反應路徑如圖1所示。檸檬醛的選擇性加氫產物-香葉醇（geraniol）為合成維生素A、E的重要中間體；其本身入藥亦具有抗菌和驅蟲的功效；同時，其臨床治療慢性支氣管炎效果也較好，不僅有改善肺通氣功能和降低氣道阻力的作用，而且對提高機體免疫功能也頗有裨益[6]。因此，對合成香葉醇的研究具有非常重要的學術意義及經濟價值。

圖1 檸檬醛加氫反應路線

香葉醇雖然用途廣泛，但在自然界中存在較少，化學工業(yè)上主要通過選用合適的催化劑對檸檬醛加氫獲取。由于檸檬醛分子中 C=C鍵的鍵能（615 kJ/mol）小于C=O鍵的鍵能（715 kJ/mol）[7]，因此，從熱力學角度看，加氫反應更易在C=C鍵上發(fā)生，對不飽和醇的選擇性較差。目前，對香葉醇的合成普遍采用貴金屬催化劑，通過改變載體結構、活性中心、溶劑等因素提高對中間產物的選擇性[8-11]。例如，Malathi等[11]以 TiO2為載體，制備5%Pt/TiO2，考察檸檬醛催化加氫制備香葉醇的性能，結果表明，以95%乙醇為溶劑，45 ℃及常壓條件下，反應5 h后，底物轉化率為29%，而對香葉醇的選擇性則接近 100%。此類催化劑雖然具有較高的催化性能，但貴金屬（Ru、Rh、Pd、Pt、Ir、Au等）作為一類重要的戰(zhàn)略資源，其儲量相對稀少，開采、提煉成本高，導致其價格昂貴且供應量少；而大量研究表明，廉價的非貴金屬催化劑如Ni對催化生成不飽和醇的選擇性較差[12]。如何開發(fā)綠色經濟的催化體系，提高不飽和醇的選擇性，是研究者面臨的一大難題。

與傳統(tǒng)的化學催化體系相比，生物催化具有催化效率高、產物專一性強、反應條件溫和等明顯的優(yōu)勢。生物催化劑日益被人們看作是相對廉價綠色的手性催化劑，在一定程度上能夠滿足特殊的需求。近年來，利用微生物的羰基還原酶對不飽和羰基化合物進行催化加氫反應的研究已有報道。Müller等[13]采用兩相發(fā)酵法考察了不同菌種對檸檬醛催化加氫的能力。結果表明，Z. mobilis和Citrobacter freundii兩種細菌在輔酶NADPH存在的前提下，顯示出較高的檸檬醛還原酶催化活性。梅樂和等[14]使用面包酵母、XST-KO酵母和假絲酵母催化加氫香葉醇，部分得到香茅醇，為菌株的進一步篩選打下基礎。馬麗等[15]將Mucorsp. JX23的發(fā)酵液直接用于生物催化肉桂醛選擇加氫制肉桂醇的反應，取得較好的效果，肉桂醛的轉化率為 82.9%，肉桂醇的選擇性為90.4%。

本文作者利用課題組篩選的具有較高羰基還原酶活性的黏紅酵母CCZU-G5，在水相中對檸檬醛進行選擇性加氫，考察底物及輔底物濃度、反應時間對檸檬醛轉化率與香葉醇選擇性的影響，為生物催化合成香葉醇的工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

GC-950氣相色譜儀，上海海欣色譜儀器有限公司；S53紫外可見光分光光度計，上海棱光技術優(yōu)先公司；R2ID旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予化儀器制造有限公司；THZ-072 HT恒溫搖床，上海博彩生物科技有限公司。

檸檬醛，國藥上?；瘜W試劑公司；香葉醇，Sigma公司；苯酚，上海凌峰化學試劑有限公司；濃硫酸，國藥上海化學試劑公司；葡萄糖，國藥上?；瘜W試劑公司。試劑均為國產色譜純或分析純。

1.1.2 菌株

黏紅酵母：Rhodotorula mucilaginosaCCZUG5，本文作者課題組篩選并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g/L，葡萄糖2 g/L，pH 值為6。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)

從斜面上生長良好的菌體中挑取少許于液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)60 h，每隔一段時間取樣，通過對樣品吸光度（OD600）的測定，繪制菌體濃度-吸光度標準曲線及菌體生長曲線，確定其對數(shù)生長期。

1.2.2 加氫反應

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的菌體于4 ℃、8000 r/min離心10 min，棄上清液，然后用PBS溶液（0.1 mol/L，pH值為7.0）洗滌兩次后，轉移至厭氧瓶中進行催化反應。反應體系包括：菌體濃度 0.2～0.5 g/mL PBS，輔底物葡萄糖添加量10～60 g/L，底物檸檬醛添加量1～8 g/L，反應時間1～26 h。

1.2.3 產物分析

反應液離心除去菌體后，上清液用乙醚萃取，采用氣相色譜法分析檸檬醛轉化率及香葉醇選擇性。色譜條件為：檢測溫度250 ℃；汽化溫度250℃；柱溫由 80 ℃升溫至 250 ℃，升溫速率 5℃/min；載氣為氮氣，流量45 mL/min。

反應物檸檬醛的轉化率（X）及產物香葉醇的選擇性（Sgeraniol）分別表示為式（1）、式（2）。

式中，n為反應過程中的反應物或產物瞬時濃度；n0為反應的初始濃度；i為產物。

2 結果與討論

2.1 菌體生長曲線的測定

利用微生物菌體進行的催化反應，本質上是微生物體內所發(fā)生的酶反應；而酶含量的多少及酶活的高低直接決定著生物催化反應效率。由微生物的生長周期可知，當處于對數(shù)生長期末期時，微生物的數(shù)量及活力均處于相對較高的程度；而利用此時的菌體進行催化反應，可大大提高其反應效率。本實驗測定了黏紅酵母CCZU-G5在30 ℃條件下60 h內的菌體生長曲線，如圖2所示。

圖2 黏紅酵母CCZU-G5生長曲線

由圖2可以看出，黏紅酵母CCZU-G5在24 h前后開始進入對數(shù)生長期，28 h時達到對數(shù)生長期末期，此時的菌體數(shù)量達到最大，而菌體活力也相對較高，有利于提高之后所進行的加氫反應效率。因此，本文第二階段的加氫反應使用培養(yǎng) 28 h的菌體。

2.2 輔底物濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

絕大多數(shù)全細胞的不對稱催化需要有輔酶再生體系與還原反應耦合，以維持反應的進行[16]。本實驗考察了菌體濃度0.3 g/mL、檸檬醛濃度3 g/L、反應時間24 h條件下，輔底物葡萄糖濃度的變化對檸檬醛轉化率及香葉醇選擇性的影響，結果如圖3所示。

圖3 葡萄糖濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

由圖3可知，隨著葡萄糖濃度的增加，檸檬醛轉化率逐漸上升；當葡萄糖含量達到40 g/L時達到最高，約為88%；當繼續(xù)增加葡萄糖濃度時，轉化率變化趨緩。然而，葡萄糖濃度對產物香葉醇的選擇性影響不大，均保持在95%左右。因此，綜合考慮成本與來源因素，選擇40 g/L 葡萄糖輔作為輔底物用于后續(xù)實驗的研究。

2.3 檸檬醛初始濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

對生物催化而言，反應體系中不同初始濃度的底物對微生物催化的還原反應具有一定影響[17]；初始階段過多的檸檬醛將對酶活力產生較大抑制作用，不利于還原反應的發(fā)生。本實驗通過對不同初始底物濃度下轉化率和選擇性的考察，探討其對選擇性加氫反應的影響。反應體系中，菌體濃度、輔底物葡萄糖添加量及反應時間分別維持0.3 g/mL、40 g/L及24 h，底物檸檬醛添加量1～8 g/L。結果如圖4所示。

圖4 底物濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

由圖4可知，隨底物濃度的增加，檸檬醛轉化率逐漸降低，證明了檸檬醛對黏紅酵母 CCZU-G5具有一定的抑制作用；同時，當?shù)孜餄舛葟?1 g/L增加至4 g/L時，轉化率變化較為緩慢，從96%下降至89%，計算可知，活力下降僅為7.3%；而當?shù)孜餄舛瘸^4 g/L，轉化率急劇下降。當檸檬醛濃度為 8 g/L時，轉化率下降至 44%，活力下降高達54.2%。因此，4 g/L成為檸檬醛選擇性加氫反應的轉折點。但值得注意的是，檸檬醛的初始濃度對產物香葉醇的選擇性并未產生很大影響，其始終維持在95%左右。綜合檸檬醛轉化率、香葉醇選擇性及香葉醇產量等因素，檸檬醛初始濃度確定為4 g/L。

2.4 菌體濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

生物催化體系中，催化劑用量對還原反應有著直接的影響[18]。本實驗考察了40 g/L檸檬醛初始濃度，40 g/L輔底物葡萄糖濃度條件下，不同用量的菌體（0.1～0.5 g/mL）對選擇性加氫反應的影響。結果如圖5所示。

圖5 菌體濃度對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

從圖5可以看出，隨著菌體用量的增加，檸檬醛轉化率不斷增加，0.4 g/mL菌體作用下轉化率達到 88.6%；繼續(xù)提高菌體用量，轉化率不再增加。表明0.4 g/mL的菌體濃度對檸檬醛的選擇性加氫反應已達到飽和。而菌體用量的改變對產物香葉醇的選擇性影響不大，維持在95%左右。因此，最佳菌體濃度為0.4 g/mL。

2.4 反應時間對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

本實驗在確定輔底物及底物濃度，菌體用量等最佳條件后，最后考察反應時間對檸檬醛選擇性加氫反應的影響。反應體系中菌體濃度、葡萄糖及檸檬醛添加量分別維持0.4 g/mL、40 g/L及4 g/L。結果如圖6所示。

從圖中可以看出，隨反應時間的延長，檸檬醛轉化率不斷增加，反應 22 h后，轉化率達到最大（88.6%），此時對香葉醇的選擇性為95.2%。之后，反應基本趨于停滯。由此推測，反應22 h后，由于底物檸檬醛的不斷消耗及香葉醇的持續(xù)產生，對菌體中羰基還原酶的活力產生較大抑制，導致反應趨于停滯。因此，反應時間確定為22 h。

圖6 反應時間對檸檬醛選擇性加氫反應的影響

3 結 論

利用本文作者課題組篩選的黏紅酵母 CCZUG5，對檸檬醛進行選擇性加氫反應。輔底物葡萄糖、底物檸檬醛及菌體濃度分別為40 g/L、4 g/L及0.4 g/mL時，反應22 h后，檸檬醛轉化率達到最大，為 88.6%；對香葉醇的選擇性達到 95.2%。黏紅酵母CCZU-G5對選擇性加氫檸檬醛合成香葉醇具有較大的優(yōu)勢。

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