王偉潔，李紅梅，薛 芳，陳寶珍，高露嬌

（1上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

胸苷磷酸化酶廣泛存在于動植物及微生物中，并參與細胞核酸代謝途徑，在“補救途徑（salvage path）”中可催化脫氧胸苷可逆磷酸化反應(yīng)，提供脫氧核糖-1-磷酸，釋放堿基胸腺嘧啶，加入另一種堿基形成新的核苷。在生物合成核苷藥物中具有重要作用[1-2]。

核苷磷酸化酶產(chǎn)生菌主要有大腸桿菌、乙酰短桿菌、歐文桿菌、干燥棒桿菌以及佐氏庫特氏菌等[1]。關(guān)于酶法合成核苷類藥物的報道很多。如沈榮坤等[3]以大腸桿菌為酶源，利用胸腺嘧啶和2'-脫氧核苷合成胸苷；李喻等[4]利用乙酰短桿菌為酶源，胸苷和鳥苷酸為底物，2'-脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化率高達56.4%；洪云海等[5]利用乙酰短桿菌為酶源，胸苷和腺嘌呤為底物，2'-脫氧腺苷的轉(zhuǎn)化率可達 65.6%。目前利用含有核苷磷酸化酶的菌株合成核苷類藥物的轉(zhuǎn)化率均較低，其關(guān)鍵問題在于菌株含酶量很少，因此如何提高菌體含酶量從而提高單位菌體酶活以提高生物催化轉(zhuǎn)化的效率是全細胞催化研究的重點。

從文獻調(diào)研看，提高含酶量最有效最快捷方法主要是通過改良微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)基。以正交試驗、均勻設(shè)計、響應(yīng)面方法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法為代表的數(shù)學(xué)統(tǒng)計優(yōu)化方法廣泛地應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化工作中，取得了顯著的成果[6]。本研究將首次以實驗室篩選獲得的短乳桿菌作為產(chǎn)胸苷磷酸化酶菌種，將Placket-Burman設(shè)計、最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)區(qū)域以及采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計相結(jié)合對短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力進行優(yōu)化，為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)核苷及其衍生物提供實驗基礎(chǔ)[7]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

短乳桿菌為實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH值7.0～7.2。

（2）活化液 酵母膏10.0 g/L，自然pH值。

（3）初始發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2 培養(yǎng)條件

將短乳桿菌接種在固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ跓o菌環(huán)境下從斜面培養(yǎng)基上挑取兩環(huán)菌體接種到裝液量為50 mL的250 mL錐形瓶活化液中，在36 ℃搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min條件下活化10～12 h。然后以一定的接種量接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)速為 110 r/min、36 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3 分析方法

1.3.1 濕菌體的制備

將培養(yǎng)好的菌體4000 r/min離心15 min，去除上清液后，再用pH值為7.3的無菌磷酸緩沖液沖洗兩次，離心，得到濕菌體冷藏備用。

1.3.2 胸苷磷酸化酶活測定方法——紫外分光光度法

據(jù)Saunders等報道[8]，采用分光光度法測定反應(yīng)生成的胸腺嘧啶來表征產(chǎn)酶量。標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)混合液包含一定濃度的濕菌體，25 mmol/L的胸苷，1 mmol/L的EDTA，pH值為7.3、50 mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液。55 ℃條件下反應(yīng)一段時間，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在沸水中煮沸5 min終止反應(yīng)，離心去除沉淀。上清液用pH值為12的NaOH溶液稀釋100倍，然后測定290 nm的紫外吸光度OD290nm的增值[9]。胸苷磷酸化酶酶活單位定義為：在上述條件下，1 min內(nèi)OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的一個酶活力單位[12]。

1.4 實驗設(shè)計方法

1.4.1 PB設(shè)計

選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、葡萄糖、酵母膏、NaCl、蛋白胨和胸苷作為PB設(shè)計的10個因子，具體設(shè)計和分析方法參照文獻[10]進行。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)擬合的一次多項式確定最陡爬坡方向，以此逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.4.2 CCD實驗

根據(jù)PB設(shè)計以及最陡爬坡試驗確定實驗因素和水平，進行了三因素三水平的中心組合實驗，通過 Design Expert 8.0完成試驗設(shè)計并分析實驗數(shù)據(jù)。

1.4.3 SDS-PAGE電泳分析

按照優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)發(fā)酵并收集濕菌體，采用酶解-超聲耦合法破碎濕菌體制備胸苷磷酸化酶液，具體方法如下：將濕菌體按照一定濃度稀釋，在300 μg/mL的溶菌酶液下37℃酶解1.5 h，隨后將酶解液在450 W功率下超聲破碎處理12次（超聲40 s/間歇20 s），最后將破壁后的菌液在轉(zhuǎn)速為 13 000 r/min，4 ℃低溫離心 30 min，收集上清液進行SDS-PAGE電泳。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett—Burrman 設(shè)計篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蛋白胨和底物胸苷對胸苷磷酸化酶酶活有一定的促進作用，因此結(jié)合文獻資料，選取初始葡萄糖、酵母膏、NaCl、蛋白胨、胸苷、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間、接種量、發(fā)酵溫度作為PB設(shè)計的10個因素（X1、X2、X4、X5、X7、X8、X9、X11、X12、X13），具體實驗設(shè)計見表1，使用minitab15.0軟件對實驗結(jié)果進行回歸方差分析其結(jié)果見表2。

從變量的效應(yīng)可看出初始pH值、發(fā)酵溫度、酵母膏、NaCl和胸苷對短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶有正效應(yīng)，轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間、接種量、葡萄糖和蛋白胨顯示出負(fù)效應(yīng)。在置信區(qū)間95%之中，接種量、發(fā)酵時間和葡萄糖濃度相比其它因素而言對系統(tǒng)的響應(yīng)值影響較為顯著，因此確定選擇發(fā)酵時間、接種量和葡萄糖濃度 3個因素進行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件。

2.3 最陡爬坡實驗

PB設(shè)計實驗結(jié)果表明，接種量、發(fā)酵時間和葡萄糖具有負(fù)效應(yīng)，因此可通過降低接種量、發(fā)酵時間和葡萄糖濃度來提高產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力。其它因素的取值則根據(jù)正效應(yīng)的因素取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。結(jié)合實際需要，對影響顯著的 3個重要因素的步長進行相應(yīng)的設(shè)計，具體取值及實驗結(jié)果見表3。由表3可知，2號培養(yǎng)基的胸苷磷酸化酶活最高1.008 U/mg，從3號開始，胸苷磷酸化酶活明顯降低，因而選用2號所對應(yīng)的因素水平作為后續(xù)中心組合設(shè)計的中心點。

表2 Plackett-Burman實驗結(jié)果的方差分析

2.4 響應(yīng)面擬合及最優(yōu)條件的確定

根據(jù)PB設(shè)計及最陡爬坡實驗確定的實驗因素及水平，采用“Design Expert 8.0”的中心組合設(shè)計法設(shè)計3因素的CCD實驗，以胸苷磷酸化酶活為響應(yīng)值，取5個水平，以（?1.682，?1，0，1，1.682）編碼，中心點實驗重復(fù)數(shù)為6，設(shè)計20組實驗[11]，實驗水平及編碼值見表4，實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

對表5中的實驗結(jié)果進行二次多項式回歸擬合，得到胸苷磷酸化酶活對培養(yǎng)時間、接種量和葡萄糖濃度的擬合線性回歸方程如式（1）。

Y為短乳桿菌濕菌體胸苷磷酸化酶酶活的預(yù)測值；A、B、C分別為培養(yǎng)時間、接種量和葡萄糖濃度的編碼值。由表6可知，該模型極顯著（p=0.0004），在研究的整個回歸區(qū)域擬合較好，并能作出較準(zhǔn)確的預(yù)測[10]。求回歸方程式（1）得模型極值點坐標(biāo)：A=10.57 h，B=1.54%，C=18.00 g/L，此時模型預(yù)測的最大值為1.152 U/mg。由圖1可直觀地看出各因子對響應(yīng)值的影響變化趨勢，每個響應(yīng)圖分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第3個變量保持在0水平。

2.5 回歸模型驗證試驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳培養(yǎng)條件下，做5次重復(fù)實驗，得到胸苷磷酸化酶活為1.172 U/mg，基本與響應(yīng)面預(yù)測的最大1.152 U/mg符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與實驗數(shù)據(jù)擬合的較好。在初始發(fā)酵條件，短乳桿菌濕菌體胸苷磷酸化酶活為0.400 U/mg，優(yōu)化后提高了2.93倍。

2.6 SDS-PAGE分析

將優(yōu)化前和優(yōu)化后獲得的濕菌體破胞離心獲得的酶液進行SDS-PAGE分析，每個實驗平行進行3次，優(yōu)化前后胸苷磷酸化酶濃度如圖2所示。文獻資料顯示，微生物體內(nèi)含有三類核苷磷酸化酶，分別是嘌呤磷酸化酶（2.582×104）、尿苷磷酸化酶（2.8×104左右）及胸苷磷酸化酶（4.3×104左右）[12]。從圖中可以看出，在三類核苷磷酸化酶中只有胸苷磷酸化酶分子量條帶（胸苷磷酸化酶相對分子質(zhì)量4.3×104）高于優(yōu)化前，其它兩種核苷磷酸化酶的生產(chǎn)情況卻未得到改善，因此可以避免在全細胞生物催化轉(zhuǎn)化的過程中由于嘌呤磷酸酶和尿苷磷酸化酶利用內(nèi)源性底物合成非目標(biāo)核苷類物質(zhì)，從而影響胸苷磷酸化酶合成的目標(biāo)產(chǎn)物的分離。

表4 CCD實驗設(shè)計因素水平及編碼值

表5 CCD實驗設(shè)計及結(jié)果

3 結(jié) 論

微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的種類、各組分濃度及培養(yǎng)條件均會影響微生物代謝過程中產(chǎn)酶量。從文獻調(diào)研看，盡管胸苷磷酸化酶存在于許多微生物體內(nèi)，但目前關(guān)于短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶的研究鮮有報道。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件得出以下結(jié)論。

表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析

圖1 培養(yǎng)時間、接種量、葡萄糖濃度影響胸苷磷酸化酶活的響應(yīng)面圖

（1）在傳統(tǒng)的以酵母膏，葡萄糖以及氯化鈉培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加一定濃度的蛋白胨和胸苷能有效促進短乳桿菌分泌胸苷磷酸化酶。

（2）在發(fā)酵培養(yǎng)條件方面，通過優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，提高發(fā)酵溫度和采用偏堿性的pH值等（未優(yōu)化前采用32 ℃，pH 值為7.0）更有利于提高短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶。

圖2 SDS-PAGE分析短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力

（3）優(yōu)化后確定最佳培養(yǎng)基配方為：酵母膏15 g/L，NaCl 7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，胸苷15mmol/L，葡萄糖18 g /L。發(fā)酵條件為：pH值8.0，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，發(fā)酵溫度38 ℃，培養(yǎng)時間10.57 h，接種量 1.54%。在上述優(yōu)化條件下，胸苷磷酸化酶活試驗驗證值達到1.172 U/mg，與優(yōu)化前相比，酶活提高了2.93倍。

（4）采用蛋白質(zhì)凝膠電泳進行驗證，結(jié)果表明：本實驗優(yōu)化方案僅能提高單位濕菌體中胸苷磷酸化酶的含量。

總之，實驗結(jié)果顯示通過數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)方法優(yōu)化短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件是一種可行有效的方法。要進一步提高胸苷磷酸化酶活，還需在菌種選育（物理化學(xué)誘變、基因組重排技術(shù)等）、代謝調(diào)控以及擴大化培養(yǎng)條件等方面繼續(xù)研究。

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