趙 虹 張?bào)@宇 車守梅 赫丹丹 郭朝暉

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 哈爾濱 150001

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和藥物原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元來源于ICR小鼠（SLAC.CHINA）的胚胎，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保護(hù)協(xié)議由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑FK－866購(gòu)置于美國(guó)cayman化學(xué)制品公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA構(gòu)建：編碼小鼠NMNAT1基因的cDNA從小鼠腦cDNA庫(kù)中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的，所用引物：5′－ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA－3′和 5－TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG－3′，并克隆到 PIRES2－EGFP載體（Invitrogen公司）中產(chǎn)生野生型過表達(dá)NMNAT1（NMNAT1－OE）序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成：專門針對(duì)小鼠NMNAT1 mRNA三個(gè)非重疊序列設(shè)計(jì)后構(gòu)建到H1啟動(dòng)子RNAi載體上（psuper，Oligoengine，USA）。最有效的19－核苷酸靶序列 是 5′－ACGAGTGGATCACCAATGA－3′（KD－shRNA）。非特異性對(duì)照寡核苷酸設(shè)立為無關(guān)序列作為對(duì)照，該序列為：5′－TTCTCCGAACGTGTCACGT－3′（Scr－shRNA），含 干擾序列的寡核苷酸在DNA合成過程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。所有序列均被測(cè)序證實(shí)正確。

1.2.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：原代新皮層神經(jīng)元來源于剛出生小鼠（PO小鼠）的胚胎，簡(jiǎn)而言之，分離新皮層組織，在4℃含6%葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10min，并在補(bǔ)充B27添加劑（Invitrogen）0.5mmol／L、左旋谷氨酸和20mmol／L HEPES的無血清培養(yǎng)基中輕輕磨碎分離，pH 7.4，在體外培養(yǎng)3～6 d后，神經(jīng)元用于形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)的神經(jīng)元通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單地說，一個(gè)包含有質(zhì)粒、電穿孔緩沖物和神經(jīng)元的混合物移到一個(gè)的容器中，用轉(zhuǎn)染試劑盒按程序通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染。

1.2.4 免疫印記分析：神經(jīng)元溶解在細(xì)胞溶解緩沖液中（10mmol／L Tris－HCL、5mmol／L EDTA、140mmol／L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚），包含蛋白酶抑制劑的混合物中1h，1 300r離心10min，以合適的SDS－PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF（Millipore）膜上，用封閉液稀釋一抗，將已封閉的膜置于一抗溶液中4℃過夜，然后放入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中孵化（1∶5000，Jackson Immuno Research），細(xì)胞膜用熒光檢測(cè)試劑（GE，USA）檢測(cè)，小鼠的單克隆抗體和小鼠的抗－action抗體，分別來自于Santacruz（sc－30842）和Chemicon（MAB1501）。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)：細(xì)胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS緩沖液中，用5%BSA 和0.2%Ttriton－100在PBS緩沖液中封閉和透化后，細(xì)胞在一抗中4℃孵化一夜，然后細(xì)胞用Alexa488和Alexa568共軛二抗在室溫下清洗孵化1h。小鼠單克隆抗－Taul（MAB2239）和小鼠單克隆抗體Map2（AB5622）購(gòu)置于Chemicon。

1.2.6 成像和圖像分析：膠片在熒光顯微鏡下掃描（尼康，日本）。分析神經(jīng)突的延長(zhǎng)和分支，關(guān)鍵是能夠成像一個(gè)單一神經(jīng)元的全部過程，并能區(qū)別它們是軸突還是樹突，對(duì)成像軸突，需要使用相對(duì)低功率放大（20×）獲得圖像，包括神經(jīng)元的成像。對(duì)成像的樹突分支（40×）物象提供最優(yōu)放大。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用綠色熒光GFP和樹突特異性標(biāo)記MAP2免疫雙標(biāo)神經(jīng)元樹突，Neurolucida軟件用來分析樹突的生長(zhǎng)，并計(jì)算樹突的長(zhǎng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樹突的復(fù)雜度通過計(jì)算從神經(jīng)元發(fā)出的主要樹突的分支點(diǎn)計(jì)算，分析得到的數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用one－way ANOVE（方差分析）及post－h(huán)oct－test方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠NMNAT1shRNA和過表達(dá)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)元中有效構(gòu)建為研究NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)針對(duì)小鼠NMNAT1mRNA的shRNA結(jié)構(gòu)（NMNAT1KD－shRNA），我們也設(shè)計(jì)了無針對(duì)性對(duì)照的shRNA（NMNAT1Scr－shRNA），我們把每個(gè)shRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢驗(yàn)敲除內(nèi)源性NMNAT1蛋白的能力，Western－blotting分 析顯 示過 表達(dá) NMNAT1（NMNAT1－OE）高表達(dá) NMNAT1而 KD－shRNA 有效敲除了NMNAT1基因（圖1A和1B），而Scr－shRNA未影響到NMNAT1表達(dá)。這些結(jié)果證明小鼠NMNAT1過表達(dá)和干擾慢病毒載體構(gòu)建在原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元中是有效的。

2.2 NMNAT1在培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元中調(diào)控樹突的形態(tài)以前的研究顯示NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域廣泛表達(dá)，我們假定NMNAT1可能在神經(jīng)元形態(tài)方面起一定作用，為探索NMNAT1對(duì)樹突形態(tài)的作用，我們用NMNAT1過表達(dá)和NMNAT1干擾的慢病毒載體轉(zhuǎn)染了DIV0的神經(jīng)元，在DIV6用GFP和樹突特異標(biāo)記MAP2免疫雙標(biāo)這些細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NMNAT1（NMNAT1－OE）能夠增加樹突分支的數(shù)量和整個(gè)樹突的總長(zhǎng)度。相反，NMNAT1KD－shRNA損害了樹突的生長(zhǎng)，因?yàn)橐饦渫环种Ш涂傞L(zhǎng)度的減少（圖2A和2B）。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是NAD合成途徑中的限速酶，過表達(dá)煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶能在體外顯示較強(qiáng)的軸突保護(hù)功能。為證明我們實(shí)驗(yàn)性的形態(tài)學(xué)系統(tǒng)的完整性，一個(gè)高度特定的煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，與以前下調(diào)NMNAT1的數(shù)據(jù)一致，在體外2nmol／L的FK－866抑制了樹突形態(tài)的發(fā)育（圖2A和2B）?？傊?，這些結(jié)果顯示在皮層神經(jīng)元NMNAT1和樹突的發(fā)育密切相關(guān)，它能夠在皮層神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的早期促進(jìn)樹突的發(fā)育。

3 討論

最近的研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成酶煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1（NMNAT1）能夠影響小鼠和果蠅的軸突Wallerian＇s變性。NMNAT1能保護(hù)神經(jīng)元變性。然而NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中的作用還不十分清楚，是否影響樹突的發(fā)生也不清楚。NMNAT催化NAD的合成［1－2］。NAD在所有活細(xì)胞的新陳代謝中起關(guān)鍵作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為輔酶參與大量轉(zhuǎn)移反應(yīng)［3］，NMNAT1在 NAD 合成途徑中是主要酶［4］，NMNAT1顯示廣泛分布在被檢組織中，包括腦組織的各個(gè)亞區(qū)［5］。因此，尋找NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用很重要。

本研究我們研究了在體外NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元早期發(fā)育階段對(duì)神經(jīng)元形樹突發(fā)育的影響。我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了Scr－shRAN的神經(jīng)元比較，NMNAT1KD－shRNA引起了樹突分支的顯著減少以及總長(zhǎng)度的減少。且過表達(dá)NMNAT1促進(jìn)了樹突的生長(zhǎng)，這和過去報(bào)道的培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元相一致［6］。我們的數(shù)據(jù)表明NMNAT1在大腦中高水平表達(dá)，在體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中參與促進(jìn)軸突和樹突生長(zhǎng)和復(fù)雜度的形態(tài)變化。總之，我們揭示了NMNAT1在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)退行性疾病中的一個(gè)重要作用。

樹突異常和神經(jīng)退行性疾病的病理特征一致。目前，大多數(shù)的研究集中于神經(jīng)退行性疾病的遺傳綜合征，因?yàn)樗鼈兲峁┝丝赡芰私庵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)樹突異常的病因機(jī)制［7］。

一項(xiàng)在果蠅的研究表明NMNAT1是作為一個(gè)伴護(hù)蛋白而起作用［8］，關(guān)于 Wallerian＇s變性的幾項(xiàng)研究顯示，NMNAT1的NAD合成活動(dòng)需要它對(duì)軸突的保護(hù)作用［9－13］，然而對(duì)于中樞神經(jīng)元樹突是否有保護(hù)作用，尤其是神經(jīng)元經(jīng)歷變性的過程時(shí)NMNAT1是否作為一個(gè)保護(hù)蛋白或酶而發(fā)揮功能知道的很少。因此，在不同的變性過程中，NMNAT1的不同功能特征將幫助我們理解它在神經(jīng)退行性疾病中的作用。據(jù)我們所知，我們的結(jié)論是第一次展示了NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)樹突生長(zhǎng)和成熟中所起的作用。這里關(guān)于樹突形態(tài)異常與神經(jīng)變性的發(fā)現(xiàn)以及以往的關(guān)于軸突異常與神經(jīng)變性的關(guān)系支持這樣的觀點(diǎn)：NMNAT1失活在神經(jīng)元發(fā)育的早期關(guān)鍵階段影響軸突和樹突形態(tài)發(fā)育，因此導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退化，然而，NMNAT1對(duì)神經(jīng)形態(tài)和變性的影響機(jī)制還有待了解。

［1］Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Enzymology of NAD＋ homeostasis in man［J］.CellMol Life Sci，2004，61：19－34.

［2］Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Structure and function of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase［J］.Curr Med Chem，2004，11：873－885.

［3］Berger F，Lau C，Dahlmann M，et al.Subcellular compartmentation and differential catalytic properties of the three human nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase isoforms［J］.J Biol Chem，2005，280：36 334－36 341.

［4］Lau C，Niere M，Ziegler M.The NMN／NaMN adenylyltransferase（NMNAT）protein family［J］.Front Biosci，2009，14：410－431.

［5］Emanuelli M，Carnevali F，Saccucci F，et al.Molecular cloning，chromosomal localization，tissue mRNA levels，bacterial expression，and enzymatic properties of human NMN adenylyltransferase［J］.J Biol Chem，2001，276：406－412.

［6］Zhai RG，Zhang F，Hiesinger PR，et al.NAD synthase NMNA T acts as a chaperone to protect against neurodegeneration［J］.Nature，2008，452：887－891.

［7］Kaufmann WE，Moser HW.Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation［J］.Cereb Cortex，2000，10：981－991.

［8］Watts RJ，Hoopfer ED，Luo L.Axon pruning during Drosophila metamorphosis：evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin－proteasome system［J］.Neuron，2003，38：871－885.

［9］Zhai RG，Rizzi M，Garavaglia S.Nicotinamide／nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，new insights into an ancient enzyme［J］.Cell Mol Life Sci，2009，66：2805－2818.

［10］Raff MC，Whitmore AV，F(xiàn)inn JT.Axonal self－destruction and neurodegeneration［J］.Science，2002，296：868－871.

［11］Yan T，F(xiàn)eng Y，Zheng J，et al.Nmnat2delays axon degeneration in superior cervical ganglia dependent on its NAD synthesis activity［J］.Neurochem Int，2010，56：101－106.

［12］Luo L，O＇Leary DD.Axon retraction and degeneration in development and disease［J］.Annu Rev Neurosci，2005，28：127－156.

［13］Coleman M.Axon degeneration mechanisms：commonalityamid diversity［J］.Nat Rev Neurosci，2005，6：889－898.