黃 龍 王漢東 朱 林 周 淵 叢子翔

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院）神經(jīng)外科 南京 211102

目前microRNA在膠質(zhì)瘤中的研究雖然處于起步階段，但對神經(jīng)膠質(zhì)瘤中特定的microRNA研究，可為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供新的認(rèn)識。隨著miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可成為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷及判斷預(yù)后的生物標(biāo)記，成為阻止腫瘤生長的一類新藥。

1 材料與方法

1.1主要材料9例正常腦組織和9例人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本均來源于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院神經(jīng)外科研究所，且所有患者都簽署了知情同意書，均為首診首治。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購于中科院上海細(xì)胞庫，人胚胎腎細(xì)胞HEK293T購于ATCC。

1.2試劑與儀器miR－153mimics、陰性對照雙鏈小RNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），含野生型Nrf2基因3’UTR的pLUC－Nrf2雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒（WT質(zhì)粒）及其相應(yīng)結(jié)合位點突變的pLUC－Nrf2－mut雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒（MUT質(zhì)粒，廣州銳博生物科技有限公司）。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），miR－153及U6特異RT及PCR引物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司），雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)（Promega公司，美國），DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清（Hyclone公司，美國）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251及人胚腎細(xì)胞 HEK293T用含DMEM、10%FBS、100U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代，取對數(shù)期生長細(xì)胞用于實驗。

1.4 qRT－PCR實驗我們按照 Chen等［1］于2005年提出的stem－loop實時定量PCR方法檢測miRNA的表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參，以2－ΔΔCt法統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.5細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1d取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，1×PBS洗滌1次，0.25%胰蛋白酶 （不含EDTA）消化后以1×106個／孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板。用無雙抗無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24h后，按照說明書使用lipofectamin2000將 miR－153mimics和 Ngetive Control miRNA以終濃度50nm／L分別轉(zhuǎn)染到U251中。實驗分3組：空白對照組（Blank組）、Ngetive Control miRNA組（miR－153NC組）、miR－153mimics組（miR－153組）。

1.6雙熒光素酶實驗將HEK293T細(xì)胞接種到24孔板，當(dāng)細(xì)胞密度為80%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將0.5μg的報告基因質(zhì)粒和miR－153mimics或negtive control miRNA共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。按照雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)說明書檢測每組中螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性，將兩者活性的比值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參。

1.7 Western blot檢測用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠SDS－PAGE電泳，每孔上樣量為40μg總蛋白，90V電泳1～2h，電泳至溴酚藍(lán)跑到膠的下緣即可。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，200mV，2h，5%脫脂奶封閉2h，一抗孵育過夜，洗膜，二抗孵育1h，二次洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影及定影，然后膠片拍照保存。

1.8流式細(xì)胞學(xué)檢測將U251接種到6孔板，轉(zhuǎn)染48h后，按照Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS 16.0，所有定量實驗均重復(fù)至少3次，各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析（One－way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－153膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)下調(diào)與正常腦組織相比，miR－153在正常腦組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的相對表達(dá)量分別為1.04±0.07和0.14±0.03。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織組顯著低于正常腦組織組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 與正常腦組織相比，miR－153在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染miR－153mimics后U251細(xì)胞過表達(dá)miR－153

2.2轉(zhuǎn)染miR－153mimics后U251細(xì)胞過表達(dá)miR－153轉(zhuǎn)染48h后，miR－153在Blank組、miR－153NC組及 miR－153組的相對表達(dá)量分別為1.002±0.069、1.708±0.178、17.577±1.217，miR－153組與Blank組及 miR－153NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Blank組與 miR－153NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示轉(zhuǎn)染 miRNA mimics可成功過表達(dá)miRNA，見圖2。

2.3上調(diào)表達(dá)miR－153后促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染48h后，Blank組、miR－153NC組及 miR－153組的細(xì)胞凋亡率分別（3.20±0.59）%、（3.40±0.82）%、（16.51±2.14）%，可見miR－153組細(xì)胞凋亡率明顯大于另外2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Blank組與 miR－153NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示上調(diào)表達(dá)miR－153可促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡（圖3）。

圖3 miR－153誘導(dǎo)U251凋亡

2.4 miR－153靶向調(diào)控Nrf2基因根據(jù)Targetscan、Diana、Microrna.org、MiRanda、Microcosm 5種軟件預(yù)測 miR－153作用于Nrf2 3’UTR部位為圖4a中的紅色序列，與之相對應(yīng)的標(biāo)有下劃線為定點突變序列。miR－153mimics或陰性對照雙鏈小RNA與含Nrf2基因3’UTR的pLUC－Nrf2雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48h后，miR－153組的相對熒光素酶活下降49%，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而Nrf2基因3’UTR與miR－153結(jié)合位點突變后，miR－153組與陰性對照組的相對熒光素酶活性分別為（0.96±0.11）% 和（1.03±0.04）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48h后，miR－153組中的 U251細(xì)胞的Nrf2蛋白表達(dá)水平要明顯低于空白組及陰性對照組，表明miR－153可顯著抑制Nrf2蛋白的表達(dá)水平。見圖4。

圖4 Nrf2基因是miR－153的一個靶基因

3 討論

miRNA作為一類新穎的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控分子，在癌的發(fā)生過程中常處于表達(dá)失調(diào)狀態(tài)［2］。通常miRNA通過結(jié)合靶基因mRNA 3’UTR從而起到調(diào)控靶蛋白的表達(dá)。越來越多的實驗證實，miRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)病和治療中扮演了重要的角色［3－6］。在實驗中，發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，miR－153在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)。這個現(xiàn)象表明，miR－153的表達(dá)紊亂與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展有特定的關(guān)聯(lián)，從而可能為我們在膠質(zhì)瘤研究和治療上提示一種新的觀點和策略。

活化狀態(tài)的核因子相關(guān)因子2（nuclear factor E2related factor 2，Nrf2）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2起初作為細(xì)胞內(nèi)Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶重要的調(diào)控因子被人們所認(rèn)識，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Nrf2表達(dá)在許多臟器損傷中可以減少凋亡的發(fā)生［7－8］，相反下調(diào)Nrf2后則增加了凋亡的發(fā)生［9］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上起到促進(jìn)的作用［10］。在人肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和增加抗癌藥物的抵抗性［11－13］。Ren等［14］證實Nrf2的特異性抑制劑鴉膽子苦醇能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞株的凋亡，表明Nrf2可能參與了肺癌的凋亡調(diào)節(jié)。隨后研究表明下調(diào)Nrf2后，HO－1表達(dá)量下降，內(nèi)在凋亡蛋白增多，誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的凋亡［15］。此外，Reddy等［16］發(fā)現(xiàn) Nrf2通過參與 GSH 介導(dǎo)的氧化還原信號通路，緩和氧化應(yīng)激和調(diào)控細(xì)胞周期紊亂，從而達(dá)到維持基因的穩(wěn)定性、完整性的作用。在研究鐮刀型細(xì)胞貧血癥病人的血液細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)miR－144可以靶向Nrf2 mRNA，調(diào)控其表達(dá)［17］。然而，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，可靶向Nrf2的miRNA至今未研究過。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中miR－153的表達(dá)量與正常腦組織相比明顯下降，繼而通過信息工程手段預(yù)測Nrf2為miR－153的靶基因之一，miR－153可在轉(zhuǎn)錄后水平上通過結(jié)合Nrf2mRNA的3’非編碼序列抑制Nrf2蛋白表達(dá)。為了研究miR－153在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的具體作用機制，我們把miR－153mimics轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中，發(fā)現(xiàn)在體外上調(diào)表達(dá)miR－153可明顯促進(jìn)U251凋亡的發(fā)生。本實驗表明Nrf2是miR－153的一個新靶基因，證據(jù)如下：（1）人類Nrf2mRNA的3’非編碼序列包含與miR－153序列相匹配的特定序列。（2）miR－153能夠抑制融合了Nrf2 3’UTR熒光報告基因質(zhì)粒的熒光活性。（3）miR－153能夠抑制內(nèi)生源性的Nrf2蛋白表達(dá)。（4）先前實驗研究表明［15］，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)Nrf2的表達(dá)可得到與本實驗相似的結(jié)果，即轉(zhuǎn)染 miR－153mimics后，U251凋亡增多，提示 miR－153通過下調(diào)Nrf2影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長。本實驗第一次驗證了一種新的miRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中靶向調(diào)控Nrf2蛋白的表達(dá)。

本實驗表明miR－153在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251的發(fā)生發(fā)展中通過直接靶向調(diào)控Nrf2蛋白表達(dá)從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。因此，在基于miRNA治療上，miR－153可作為有效的靶向治療藥物。盡管如此，體外實驗并不能代表臨床試驗研究，未來在臨床研究中，miR－153與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的治療效果及預(yù)后關(guān)系可作為一個重要的課題進(jìn)一步研究。

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