劉金 梁義娟 劉紅梅 薛會靈 梁玲 李瑞

妊娠是一種成功的半同種異體移植，其成功依賴于母胎間的免疫平衡，妊娠中一旦免疫失衡或免疫調(diào)控紊亂可導(dǎo)致不明原因的反復(fù)流產(chǎn)、死胎或發(fā)展為子癇前期［1］。子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的、可導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡的多系統(tǒng)疾病，隨著妊娠結(jié)束，胎兒及其附屬物的排出病情將逐漸好轉(zhuǎn)，其病因一直未被闡明。近年來免疫平衡機制是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點，免疫細(xì)胞生物功能的強弱，除與其活性有關(guān)外還有賴于其在體內(nèi)的數(shù)量，淋巴細(xì)胞分型可以反映子癇前期免疫細(xì)胞的水平。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測正常妊娠及重度子癇前期孕婦外周血中淋巴細(xì)胞分型的構(gòu)成變化，探討其在子癇前期發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年10月至2011年10月就診于河北大學(xué)附屬醫(yī)院的重度子癇前期患者30例作為病例組，所有病例均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，平均年齡(28.8±2.1)歲，孕周(35.5±2.5)周;另選擇同期住院分娩的健康孕婦20例作為正常組，平均年齡(28.0±2.7)歲，孕周(39.0±1.8)周。所有孕婦均為單胎妊娠，既往無慢性高血壓、糖尿病、腎炎、心臟病等內(nèi)科疾病，無輸血、移植、免疫治療病史。2組一般資料具有均衡性。

1.2 標(biāo)本采集與處理 于治療前抽取2組靜脈血2 ml注入肝素抗凝管中，室溫放置不超過2 h，待檢測。

1.3 方法 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血中各組淋巴細(xì)胞水平。流式細(xì)胞儀型號BD FACSCalibur(美國)、試劑盒。(1)采集抗凝外周血，按下述步驟進(jìn)行熒光染色;(2)在5個流式檢測管中分別加入(a CD3-FITC/CD19-PE;b CD3-FITC/CD4-PE;c CD3-FITC/CD8-PE;d CD3-FITC/CD16+CD56-PE)和陰性對照(IgG1-FITC/IgG2a-PE)各20μl;(3)每管加100μl(1×106/L)樣品，室溫避光孵育20 min;(4)每管加入1x溶血素2 ml充分震蕩混勻，室溫避光溶血10 min，以1 000 r/min離心5 min;(5)棄上清，加入2 ml PBS震蕩混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清;(6)重復(fù)步驟(5);(7)加入500μl PBS混勻，上機檢測，每個樣品收集20 000個細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，2組間比較采用成組設(shè)計比較的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

外周血中淋巴細(xì)胞分型變化 病例組與正常組外周血中CD3+T細(xì)胞水平無明顯差異，但從其亞群上觀察有變化：病例組CD4+T細(xì)胞較正常組升高(P＜0.05);病例組CD8+T細(xì)胞較正常妊娠組明顯下降(P＜0.05);病例組外周血中自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)水平明顯升高(P＜0.05);病例組與正常組外周血中B細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 外周血淋巴細(xì)胞分型變化±s

表1 外周血淋巴細(xì)胞分型變化±s

t值1.673 2.272 3.905 9.199 0.967 P值0.101 0.028 0.000 0.000 0.338

圖1 外周血淋巴細(xì)胞分型變化

3 討論

正常妊娠過程中攜帶有父源性人類白細(xì)胞抗原的胎兒直接接觸富含免疫活性細(xì)胞的母體蛻膜，沒有遭到母體免疫系統(tǒng)的識別和排斥，相反母體與胎兒“和平共處”，這種特殊的狀態(tài)即“母胎免疫平衡”。如果這種免疫平衡被打破，將產(chǎn)生一系列的妊娠期疾病，如反復(fù)自發(fā)性流產(chǎn)、死胎、子癇前期等病理妊娠情況［3，4］。正常的免疫功能要求反應(yīng)水平既不能過低也不能亢進(jìn)，同時還要求各免疫細(xì)胞數(shù)量之間維持動態(tài)平衡，過多過少均會發(fā)生免疫失衡。淋巴細(xì)胞分型是反映子癇前期免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。免疫細(xì)胞主要指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞。T細(xì)胞來源于骨髓多能干細(xì)胞，在胸腺中分化成熟。不同發(fā)育階段的T細(xì)胞有不同的表面分子標(biāo)志，即有不同的分化抗原，幾乎所有的T細(xì)胞皆表達(dá)CD3分子。CD3+T細(xì)胞可可分為兩大類：一類是CD4+T細(xì)胞，這類細(xì)胞主要參與輔助作用(TH)及遲發(fā)性超敏反應(yīng)(TDTH);另一類是CD8+T細(xì)胞，它們的主要功能是細(xì)胞毒作用(TC)及免疫抑制作用(TS)。

在本研究中，我們選取重度子癇前期患者作為病例組，目的是通過典型病例的比較可以更清晰地顯示差別。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組與正常妊娠組外周血中T淋巴細(xì)胞總水平無明顯差異，但其亞群水平上有變化。CD4+T細(xì)胞在病例組較正常妊娠組升高(P＜0.05);CD8+T細(xì)胞在病例組較正常妊娠組明顯下降(P＜0.05)。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)執(zhí)行的功能不同，可以推斷子癇前期患者體內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)減弱，免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡，導(dǎo)致免疫紊亂，發(fā)生子癇前期的病理變化，進(jìn)而出現(xiàn)子癇前期的一系列癥狀。本研究結(jié)果與Dimitrakova 等［5，6］結(jié)果一致。

NK細(xì)胞大部分表面有CD16和CD56，這兩種分子在其他細(xì)胞表面一般不表達(dá)或表達(dá)較低，故通常將CD16和CD56作為NK細(xì)胞的標(biāo)志性分子，其作用主要表現(xiàn)在免疫監(jiān)視，清除少量變異的或“非己”細(xì)胞，抗腫瘤、抗病毒等作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者可發(fā)生類似腎移植急性排斥反應(yīng)的血管病變，且隨胎兒及其附屬物的排出，母體恢復(fù)正常［8］，由此推測NK細(xì)胞也參與子癇前期的發(fā)生。本研究同樣也觀察了外周血中NK細(xì)胞數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)子癇前期組NK細(xì)胞明顯升高(P＜0.05)。即子癇前期患者體內(nèi)免疫活動是增強的，NK細(xì)胞升高，使免疫微環(huán)境遭到破壞，同時發(fā)揮細(xì)胞毒作用，增強母體對胎兒的排斥作用。至于B細(xì)胞變化不大，在子癇前期的發(fā)生機制中可能意義不大。

總之，鑒于T細(xì)胞及NK細(xì)胞在維持母胎免疫平衡作用中發(fā)揮的重要作用，今后我們可以從免疫細(xì)胞功能活性等方面著手研究子癇前期的發(fā)生機制，為子癇前期的監(jiān)測及治療提供理論依據(jù)。

1 Darmochwal KD，Saito S，Rolinski J，etal.Activated T lym-phocytes in preeclampsia.Am J Reprod Immunol，2007，58：39-45.

2 樂杰主編.婦產(chǎn)科學(xué).第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.231.

3 Wilczynski JR.Munological analogy between allograft rejection，recurrent abortion and preeclampsia the same basic mechanism.Hum Immunol，2006，67：492-511.

4 鄭蓉，孫麗芳，董麗.孕中期血小板與子癇前期的關(guān)系.河北醫(yī)藥，2012，34：191-192.

5 Dimitrakova DE，Milchev N，Pavlov P，etal.Lymphocyte populations and subpopulations in peripheral blood ofpregnant women with preeclampsia.Akush Ginekol(Sofiia)，2005，44：40-44.

6 黎燕，蘇放明.子癇前期患者及正常孕婦外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化.實用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23：1818-1820.

7 趙武述主編.免疫平衡研究及其臨床意義.第1版.北京：科學(xué)出版社，2005.15-24.

8 Chaouat G，Ledee-bataile N，Zourbas S，etal.Implantation can immunological parameters of implantation failure be of interest for preeclampsia.Reprod Immunol，2003，59：205-217.