安建華 趙軍魁 王云輝

隨著現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各種致傷因素不斷增加，創(chuàng)傷已成為臨床上常見(jiàn)的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，創(chuàng)傷是45歲以下人類死亡的第1位原因，是所有人類死亡的第3位原因［1］。而現(xiàn)代創(chuàng)傷的一大特點(diǎn)就是創(chuàng)傷患者大多都伴有創(chuàng)傷-失血性休克，因此對(duì)其研究成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，對(duì)于創(chuàng)傷失血性休克尤其是重癥創(chuàng)傷失血性休克尚無(wú)有效的救治方法，其傷亡率和致殘率很高，嚴(yán)重威脅人類生命和生存質(zhì)量。本研究通過(guò)建立大鼠重度創(chuàng)傷-失血性休克模型，通過(guò)常規(guī)的乳酸林格氏液復(fù)蘇以及應(yīng)用血必凈注射液復(fù)蘇進(jìn)行比較，以期為臨床上救治創(chuàng)傷-失血性休克患者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠56只(由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)，體質(zhì)量220～270 g，隨機(jī)分為3組：假休克組(A組，n=8)，動(dòng)物只分離組織并行血管插管，不進(jìn)行放血及造成骨折，穩(wěn)定10 min后開(kāi)始取血液;乳酸林格氏液復(fù)蘇組(B組，n=24)：模型制作成功后，將血液回輸并輸入兩倍量的乳酸林格氏液進(jìn)行復(fù)蘇，在30 min內(nèi)給完。血必凈治療組(C組，n=24)：血必凈4 ml/kg(天津紅日藥業(yè))加入乳酸林格氏液，余同上組復(fù)蘇，待實(shí)驗(yàn)大鼠蘇醒后放入籠中自由進(jìn)食進(jìn)水，再按時(shí)間段分為復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h，到時(shí)間點(diǎn)，麻醉大鼠后打開(kāi)腹腔距回盲部5 cm處取10 cm小腸組織冰凍，制備成小腸勻漿，檢測(cè)腸組織中丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量，最后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2 創(chuàng)傷失血性休克模型制作 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、不禁水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重后用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，分離右側(cè)股動(dòng)、靜脈分別行插管術(shù)，股動(dòng)脈用于放血及監(jiān)測(cè)血壓，股靜脈用于補(bǔ)液。用骨鉗致大鼠左股骨干中下1/3處粉碎性骨折(無(wú)明顯外出血)。然后經(jīng)右股動(dòng)脈導(dǎo)管緩慢放血，在10 min內(nèi)使大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)降至(35±5)mm Hg，其間根據(jù)大鼠血壓的上下波動(dòng)繼續(xù)放血或經(jīng)股靜脈回輸少量血液，并將此動(dòng)脈血壓值維持90 min，完成大鼠創(chuàng)傷-失血性重度休克模型［2］。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小腸勻漿的制備：稱取凍存的組織200 mg，用眼科小剪盡快剪碎，將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，加入1.8 ml冷0.9%氯化鈉溶液，用組織勻漿機(jī)制備，勻漿時(shí)間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～5次，以上操作都在冰水中進(jìn)行。將制備好的勻漿用低溫低速離心機(jī)3 000 r/min左右離心10～15 min，取上清備用。

1.3.2 小腸勻漿中MDA的測(cè)定：測(cè)定原理：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作(過(guò)程略)。

1.3.3 小腸勻漿中SOD的測(cè)定：測(cè)定原理：通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色機(jī)的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)得其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含有SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)氧品中的SOD活力。測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作(過(guò)程略)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸勻漿中MDA 大鼠休克后復(fù)蘇2組腸組織中的MDA含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);加用血必凈注射液復(fù)蘇，其腸組織中MDA的含量較單純應(yīng)用乳酸林格氏液復(fù)蘇有所下降，但各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值仍高于對(duì)照組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組小腸組織中MDA的含量比較nmol/mgprot，±s

表1 3組小腸組織中MDA的含量比較nmol/mgprot，±s

注：與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

2.2 小腸勻漿中SOD 休克后復(fù)蘇2組腸組織中的SOD含量與對(duì)照組比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均出現(xiàn)明顯的下降(P＜0.05);加用血必凈注射液復(fù)蘇，其腸組織中SOD的含量較單純應(yīng)用乳酸林格氏液復(fù)蘇有所升高，但各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值仍低于對(duì)照組(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組小腸勻漿中SOD活力比較nU/mgprot，±s

表2 3組小腸勻漿中SOD活力比較nU/mgprot，±s

注：與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

2.3 3組動(dòng)物病死率的比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中A組無(wú)動(dòng)物死亡，其余各試驗(yàn)組動(dòng)物均有動(dòng)物死亡，C組較B組死亡率在12 h、24 h降低(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組動(dòng)物死亡率比較只(%)

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克是指創(chuàng)傷引起全身組織血液灌流量不能滿足機(jī)體需要的病理生理過(guò)程。其機(jī)制較為復(fù)雜，創(chuàng)傷后產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子對(duì)創(chuàng)傷后的進(jìn)程有著至關(guān)重要的影響［3］，隨著對(duì)腸道黏膜屏障功能的進(jìn)一步深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在休克的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腸道作為應(yīng)激的“中心器官”“啟動(dòng)器”［4，5］，起著非常重要的作用。休克的發(fā)生可導(dǎo)致腸道黏膜屏障的損傷，而腸道粘膜屏障的損傷可進(jìn)一步加重休克，防止休克時(shí)腸道黏膜屏障的損傷對(duì)抗休克治療起到非常重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷是失血性休克后腸道損傷的主要機(jī)制之一，正常情況下，胃腸道血流占心排出量的15% ～20%，當(dāng)休克處于休克代償期時(shí)機(jī)體為保證重要器官的功能，交感神經(jīng)髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，而腸道對(duì)兒茶酚胺敏感性較高，腸道黏膜血管收縮，血流下降，并且由于腸黏膜絨毛小血管成“發(fā)卡”狀［6］，血液易從小靜脈短路進(jìn)入小靜脈，引起腸粘膜缺血。在失代償期腸道微循環(huán)淤血進(jìn)一步加重了胃腸道缺血、缺氧狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道的血流量不僅下降的早而且恢復(fù)晚［7，8］，當(dāng)缺血的腸道恢復(fù)血流再灌住后，次黃嘌呤-黃嘌呤系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生大量有毒性的活性氧代謝產(chǎn)物(Reactive Oxygen Species，ROS)，包括超氧陽(yáng)離子(O-)，過(guò)氧化氫(H2O2)，羥自由基(OH-)等，這樣物質(zhì)可損傷腸黏膜細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，使細(xì)胞通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，而腸組織富含黃嘌呤氧化酶，因而所受損傷更重。一旦體內(nèi) ROS的平衡被破壞，將導(dǎo)致ROS的過(guò)量產(chǎn)生，繼而引起組織結(jié)構(gòu)和功能變化 因此，減少腸道分泌ROS，可能使腸道細(xì)胞減少損害減輕腸道的通透性，從而降低腸道細(xì)菌移位，避免進(jìn)一步發(fā)展為腸源性多臟器功能衰竭(MODS)。所有的活細(xì)胞中均可產(chǎn)生氧自由基，但過(guò)量的氧自由基則對(duì)機(jī)體有害，故正常機(jī)體內(nèi)存在一套有效的抗氧化防御系統(tǒng)可以清除氧自由基及其代謝產(chǎn)物，如過(guò)SOD，GSH，GSHPx，它們的變化反映了體內(nèi)的抗氧化功能，可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力;丙二醛(MDA)則是反映機(jī)體內(nèi)活性氧含量高低的較好指標(biāo)。SOD是超氧陰離子自由基(O2-)的特異性清除酶，通過(guò)歧化反應(yīng)使O2-生成過(guò)氧化氫，后者在過(guò)氧化氫酶的作用下生成水。因此，SOD可阻止氧自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)大，可以認(rèn)為它是生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的重要防線［9］。

本試驗(yàn)選用SOD、MDA作為活性氧損傷的指標(biāo)。SOD活性的下降及MDA水平的上升是活性氧損傷的證據(jù)，二者結(jié)合分析有助于判斷脂質(zhì)過(guò)氧化及再灌注損傷程度。B、C組 MDA在休克復(fù)蘇后時(shí)開(kāi)始升高，24 h達(dá)到高峰，表明休克后盡管給予有效的液體復(fù)蘇，腸道缺血再灌注引起的活性氧仍在繼續(xù)升高。

血必凈注射液的主要成分為赤芍藥、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等活血化瘀藥?；钛鲋兴幙赏ㄟ^(guò)消除超氧自由基，改善缺血再灌注損傷途徑遏制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，赤芍藥、川芎、丹參等可抑制局部脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高抗氧化酶活性［10，11］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到在乳酸林格氏液復(fù)蘇后大鼠血漿中的MDA仍然維持較高的水平，說(shuō)明此時(shí)由于腸道缺血再灌注，炎性介質(zhì)的大量釋放，導(dǎo)致腸道細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增高，增加了腸道的通透性，而血必凈在復(fù)蘇后下降，同時(shí)抗氧化物SOD較單純應(yīng)用乳酸林格氏液復(fù)蘇各時(shí)間點(diǎn)均升高，提示血必凈注射液具有減少炎性介質(zhì)釋放，抑制活性氧的作用，從而降低了腸道通透性，減輕了腸道的進(jìn)一步損傷。

但本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在乳酸林格氏液復(fù)蘇的同時(shí)加用血必凈后的大鼠死亡率與單純應(yīng)用乳酸林格氏液復(fù)蘇的病死率明顯降低，提示在創(chuàng)傷-失血性休克后機(jī)體的病生理變化機(jī)制非常復(fù)雜，單純應(yīng)用一種藥物可能起的作用不是很大，可考慮多種藥物聯(lián)合應(yīng)用可能更有價(jià)值。

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