韓方征

目前，對(duì)實(shí)體腫瘤的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)趨勢(shì)，尤其對(duì)腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)及受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)的研究［1］，其與腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展直至轉(zhuǎn)移都密不可分，本文中所研究的不同亞型腎癌(renal cell carcinoma，RCC)，作為富血管腫瘤，MVD的研究尤為重要，研究表明，腎癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)階段性的，多因素的十分復(fù)雜的過(guò)程，腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生促內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子不足的現(xiàn)象，因而內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)快速增殖，新增生的內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)受體RTK的產(chǎn)生，因其與本身特異性的結(jié)合，促使腫瘤血管新生［2，3］，并大量增加，因而對(duì)RTK的研究在臨床上也十分重要。本研究采用免疫組化SP法分析檢測(cè)CD34、CD31所標(biāo)記的MVD值在不同亞型腎癌中的差異性，檢測(cè)RTK在不同亞型腎癌中表達(dá)之間的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2008年3月至2011年6月收治的128例腎癌患者為研究對(duì)象，整理患者術(shù)后標(biāo)本，由專(zhuān)業(yè)病理醫(yī)師依據(jù)腎腫瘤病理診斷標(biāo)準(zhǔn)(世界衛(wèi)生組織2004年制定)將其重新分級(jí)。128例患者中，男76例，女52例;年齡31～80歲，平均年齡(51.3±1.4)歲;其中腎乳頭狀癌33例，腎透明細(xì)胞癌66例，腎嫌色細(xì)胞癌29例，病理組織學(xué)分為3個(gè)級(jí)別，1級(jí)11例，2級(jí)41例，3級(jí)51例，4級(jí)25例，臨床分期也分為3階段，Ⅰ階段40例，Ⅱ階段31例，Ⅲ期30例，Ⅳ期27例，術(shù)前，全部患者未經(jīng)化療、放療及免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 試劑選擇：選擇DAKO公司生產(chǎn)的CD34、CD31鼠抗人單克隆抗體，由美國(guó) SANTA CRUZ生物技術(shù)公司［4］生產(chǎn)的RTK相關(guān)抗體，其中包括(兔抗人VEGFR-1多克隆抗體、兔抗人VEGFR-2多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、兔抗人PDGFR-Q多克隆抗體、兔抗人PDGFR-B多克隆抗體、鼠抗人C-kit單克隆抗體)。免疫組化SP法試劑盒及(二氨基聯(lián)苯胺)DAB顯色試劑盒，選擇上?；蚬境銎罚?］。

1.2.2 檢測(cè)準(zhǔn)備：①切片處理：使用洗潔精清洗載玻片，隨后做烤干處理，再使用清潔液行浸泡處理，時(shí)間約為24 h，再經(jīng)流水充分沖洗后，送進(jìn)烤箱烘干，經(jīng)濃度為95%的乙醇浸泡約7～10 h后，經(jīng)烤箱烘干處理后，可將經(jīng)新鮮配置的防脫片膠涂在載玻片上，將每張玻片放入膠液中浸泡約40 s，再經(jīng)丙酮溶液漂洗處理約10 s，漂洗共2次，將多余的膠液洗凈，最后送入烤箱進(jìn)行烘干處理后備用。②石蠟切片：行常規(guī)切片處理，經(jīng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)4μm厚度進(jìn)行切片，最后經(jīng)展片與烤片等技術(shù)進(jìn)行處理，再制作成石蠟切片，將組織切片放置于烤箱，烤箱溫度以65°左右為宜，保存約6 h備用。③染色處理：行HE染色處理，經(jīng)15 min行2次二甲苯脫蠟處理，無(wú)水乙醇2次，乙醇溶液95%10 min處理，再經(jīng)80%乙醇溶液10 min處理，5 min蒸餾水清洗，再放置于蘇木素染料中1 min，進(jìn)行染色處理，取出自來(lái)水清洗，經(jīng)濃度為1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化，0.1%的氨水返藍(lán)，再水洗，經(jīng)蒸餾水清洗后放置于伊紅染料中進(jìn)行染色，最后再蒸餾水沖洗，使用中性樹(shù)膠封片。

1.2.3 檢測(cè)方法：CD34、CD31及RTK均應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)，具體步驟參照免疫組化SP試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照其上提供的具體步驟進(jìn)行操作及染色處理。CD34及CD31在光鏡下顯示，染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，MVD值量化分析可采用Weidner提出的方法進(jìn)行操作。RTK相關(guān)受體，其中包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)，血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet—derived growth factor receptor，PDGFR-α、PDGFR-β)，干細(xì)胞因子受體(“Kitten”，stem cell factor receptor，C-kit)，這些受體均以細(xì)胞膜顯現(xiàn)顯著黃色或顆粒狀被視為陽(yáng)性著色，應(yīng)用Shimizu提出的方法進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性應(yīng)用Spearman等級(jí)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標(biāo)記的MVD值比較腎透明細(xì)胞癌與腎乳頭狀癌和腎嫌色細(xì)胞癌比較，CD34與CD31標(biāo)記的MVD值均明顯較高(P＜0.05)，腎透明細(xì)胞癌組織中，CD34與 CD31分別標(biāo)記的 MVD值比較，CD34高于CD31，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而腎嫌色細(xì)胞癌與腎乳頭狀癌組織比較，CD34標(biāo)記的MVD值顯著高于CD31標(biāo)記的MVD值(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標(biāo)記的MVD值比較±s

表1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標(biāo)記的MVD值比較±s

注：與腎透明細(xì)胞癌比較，*P＜0.05

腎嫌色細(xì)胞癌(n=29) 48±14* 31±16* 3.270 ＜0.05腎透明細(xì)胞癌(n=66)126±47 99±55 0.091 ＞0.05

2.2 不同亞型腎癌臨床病理學(xué)與CD34、CD31標(biāo)記MVD值的關(guān)系 CD34、CD31所標(biāo)記MVD值與腎透明細(xì)胞癌組織學(xué)分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)性，其中CD34標(biāo)記MVD值(r=-0.597，P=0.003)，CD31 標(biāo)記 MVD 值(r=-0.401，P=0.010)，且CD34標(biāo)記MVD值的相關(guān)性較高(P ＜0.05)。CD34、CD31標(biāo)記的MVD值與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期階段也均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其中CD34標(biāo)記MVD值(r=-0.267，P=0.023)，CD31標(biāo)記MVD值(r=-0.251，P=0.041)，且CD34相關(guān)性較高(P＜0.05)。而在腎乳頭狀癌與腎嫌色細(xì)胞癌組織中，CD34與CD31標(biāo)記的MVD值與其組織學(xué)分級(jí)、臨床分期均無(wú)相關(guān)性。

2.3 不同亞型腎癌間的表達(dá)中RTK與其相關(guān)性分析 在腎乳頭狀癌組織的表達(dá)中，RTK受體中的VEGFR-1及VEGFR-3與其呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性(r=0.304，P=0.001);VEGFR-2及VEGFR-3與其呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(r=0.458，P=0.001)，而VEGFR-l與VEGFR-2未發(fā)現(xiàn)與其有相關(guān)性(P＞0.05)，PDGFR-α及PDGFR-β均未發(fā)現(xiàn)與其有相關(guān)性(P ＞0.05)，在腎嫌色細(xì)胞癌與腎透明細(xì)胞癌組織中，各個(gè)指標(biāo)之間均未發(fā)現(xiàn)與其有相關(guān)性(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

腎癌的發(fā)展及預(yù)后與新生微血管有密切關(guān)系，因而研究MVD有重要意義，本文應(yīng)用兩種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34與CD31對(duì)不同亞型腎癌組織的微血管進(jìn)行標(biāo)記，觀察其MVD值的變化，結(jié)果顯示，腎透明細(xì)胞癌與腎非透明細(xì)胞癌組織比較，CD34與CD31標(biāo)記的MVD值均明顯較高(P＜0.05)，這與Baldewijns［6］的研究結(jié)果相似，這與腎透明細(xì)胞癌中的(VonHppel-Lindau，VHL)基因發(fā)生突變?cè)斐善涞鞍坠δ馨l(fā)生變化有密切關(guān)聯(lián)，VHL蛋白出現(xiàn)變化［7，8］，血管新生與促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)方面的相關(guān)基因被激活，而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)，微血管密度MVD值與VEGF具有正相關(guān)性，這是造成其明顯升高主要因素。而從腎透明細(xì)胞癌病理組織學(xué)及臨床分期方面分析發(fā)現(xiàn)，CD34與CD31標(biāo)記的MVD值均與其組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)性，其腫瘤組織惡性程度越嚴(yán)重，MVD值相對(duì)越低，預(yù)后差，同時(shí)，CD34與CD31標(biāo)記的MVD值與腫瘤臨床分期也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，臨床分期越高，預(yù)后越差，MVD值越低，本文結(jié)果與大多數(shù)研究結(jié)果相似。

同時(shí)通過(guò)CD34與CD31對(duì)不同亞型腎癌血管的標(biāo)記染色處理，結(jié)果表明，于腎透明細(xì)胞癌組織中，二者標(biāo)記的MVD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但CD34略高于CD31，而在腎嫌色細(xì)胞癌與腎乳頭狀癌中，CD34與CD31所標(biāo)記的MVD值比較，CD34顯著高于CD31，可見(jiàn)CD34反應(yīng)更為敏感，能夠突出尚不成熟的微血管，其表達(dá)更加穩(wěn)定，是檢測(cè)MVD值的最佳標(biāo)記物。

此外，本文研究發(fā)現(xiàn)RTK受體與促進(jìn)腫瘤血管新生有關(guān)，通過(guò)其在不同亞型腎癌表達(dá)間的相關(guān)系分析，得出結(jié)果顯示，在腎乳頭狀癌中，VEGFR-1及VEGFR-3與其呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性，VEGFR-2及VEGFR-3與其呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性，由此可見(jiàn)，這幾種受體間存在相互作用，相互誘導(dǎo)的因素，且表明了在VEGF因子異常時(shí)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了增殖活性升高的現(xiàn)象。

總之，隨著對(duì)CD34、CD31等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的研究，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)腫瘤微血管的研究也會(huì)隨之進(jìn)步，為微血管密度與腫瘤轉(zhuǎn)移分型的關(guān)系的研究提供更加有利的條件，而對(duì)檢測(cè)RTK在不同亞型腎癌中的表達(dá)相關(guān)性，也將成為判斷腎癌，尤其是腎乳頭狀癌預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床制定有效的個(gè)性化的治療方案提供更加有力的依據(jù)，有十分重要的意義和價(jià)值。

表2 腎乳頭狀癌組織中RTK表達(dá)之間的相關(guān)性分析

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