薛軍 武雪亮 賈光輝 王立坤 趙秀芳

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］，其5年生存率徘徊在50% ～60%［2］。結(jié)直腸腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的主要原因。抑癌基因RUNX3是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制基因，能調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞的凋亡，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他生物學(xué)效應(yīng)有著重要而復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［3］。它的異常表達(dá)和人類的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［4］。因此推測(cè)RUNX3蛋白在結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展中具有重要作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了RUNX3蛋白在結(jié)直腸癌的常見類型腺癌組織和結(jié)直腸正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)合臨床病理資料，探討其與結(jié)直腸腺癌發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取60例蠟塊標(biāo)本，均來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科、河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科2008年1至12月的手術(shù)切除標(biāo)本。癌標(biāo)本取白腫瘤中心處，正常組織標(biāo)本取自距腫瘤邊緣＞10 cm處。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，無其他部位原發(fā)腫瘤，均為首次診治患者，術(shù)前無放療、化療和免疫治療史。標(biāo)本取材后，部分置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)到-80℃冰箱中保存;部分標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 試劑與方法 采用免疫組化(SP-9000通用型二步法檢測(cè))。1抗RUNX3兔抗人單克隆抗體購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購(gòu)于TIANGEN公司。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.1 收集結(jié)直腸腺瘤組織及結(jié)直腸癌組織組織標(biāo)本蠟塊并切片:切片厚度4μm。蘇木素-伊紅(hematoxylin-esin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察做出病理診斷。

1.2.2 免疫組化方法(SP-9000通用型二步法檢測(cè))測(cè)各組RUNX3蛋白表達(dá)。將標(biāo)本置于80℃烤箱中烤片30 min;然后脫水、水化140℃高壓蒸汽枸櫞酸緩沖液修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶;PBS洗3次，加入一抗，4℃冰箱過夜;PBS洗3次，加入二抗，PBS洗3次。DAB工作液室溫顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，1%的鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗5 min;梯度乙醇脫水、松節(jié)油透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。RUNX3免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 結(jié)果判定 結(jié)果判定參考Dorudi等的方法，綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度來判定結(jié)果:計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并賦予分值，≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分;觀察著色強(qiáng)度并賦予分值，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分。兩者相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)，(+)～(+++)均視為陽(yáng)性。由3名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，確定免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)RUNX3在結(jié)直腸癌中的表達(dá) 結(jié)直腸癌中RUNX3的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，在60例標(biāo)本中，RUNX3蛋白在正常組織和結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率分別是86.67%和38.33%。RUNX3在癌旁正常粘膜表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。見表1，圖1。

2.2 RUNX3蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，RUNX3的表達(dá)與結(jié)直腺腸癌的TNM分期、腸壁侵潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、分化程度和組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

圖1 免疫組化RUNX3在結(jié)直腸組織中的表達(dá)(IHC×400)

表1 RUNX3蛋白在結(jié)直腸癌及正常組織表達(dá)的陽(yáng)性率

表2 RUNX3蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

RUNX3基因系RUNX一族，位于人染色體lp36.1上，全長(zhǎng)約67kb，含有6個(gè)外顯子及Pl、P2兩個(gè)啟動(dòng)子。Pl啟動(dòng)子含有一個(gè)E盒并有大量的T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(Ikaros、EtS、CREB/ATF)結(jié)合位點(diǎn)。P2啟動(dòng)子含有CCAAT盒、E盒及SP1和Egr21結(jié)合位點(diǎn)，主要轉(zhuǎn)錄RUNX3mRNA。兩個(gè)啟動(dòng)子的GC含量不同，P2啟動(dòng)子GC含量達(dá)64%，較P1啟動(dòng)子高。它與靠近外顯子2部位的CpG島一樣，理論上更易發(fā)生甲基化［5］。RUNX3基因的編碼產(chǎn)物RUNX3蛋白是由4個(gè)氨基酸殘基形成的α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其氨基末端含有一個(gè)由128個(gè)氨基酸組成的包含一個(gè)S型免疫球蛋白折疊的RD(Runt domain)保守域。亞單位α介導(dǎo)RD(Runt domain)與DNA的結(jié)合以及蛋白之間的相互作用;β能穩(wěn)定Runx3蛋白并增強(qiáng)RD與靶 DNA 的結(jié)合力［6］。

RUNX3基因作為一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，能調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育及凋亡，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他生物學(xué)效應(yīng)有著非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。因其表達(dá)下調(diào)在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用而受到更多關(guān)注。目前，研究比較深入的是其在轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的作用。RUNX3蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，而TGF-β是許多細(xì)胞生長(zhǎng)的有效抑制因子，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生［7］。TGF-β信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad蛋白介導(dǎo)，而在TGF-β信號(hào)通路中，Smad4是個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。TGF-β與 RUNX3相互作用后可以激活Smad2和Smad3，從而誘導(dǎo)相關(guān)目的基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［8，9］。因而認(rèn)為RUNX3基因在因TGF-β信號(hào)通路及Smad蛋白致瘤作用中起承擔(dān)非常重要的角色［10］。此外，Min等［11］發(fā)現(xiàn)RUNX3在MST(mammaliansterile20-like kinase)信號(hào)通路中是一個(gè)重要且在進(jìn)化上保守的元件。其中，SAV1/WW45(salvador homolog 1，WW45)能促進(jìn)MST2和RUNX3之間的密切聯(lián)系，而MST2反過來也可以刺激SAV1-RUNX3相互作用。表明RUNX3作為MST信號(hào)通路的終端效應(yīng)器而且在MST和SAV1的協(xié)助下能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)Runx3可以通過調(diào)節(jié)TIMP-1、VEGF、CRK-11等分子的表達(dá)抑制胃腸道腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

本實(shí)驗(yàn)研究表明結(jié)直腸腺癌組織中RUNX3蛋白表達(dá)低于正常組，說明RUNX3蛋白可抑制結(jié)直腸腺癌的發(fā)生，在病理狀態(tài)下呈低表達(dá)，同時(shí)RUNX3蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲力呈負(fù)相關(guān)，對(duì)結(jié)直腸腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有阻遏作用，有望成為結(jié)直腸腺癌預(yù)后判斷的新指標(biāo)。

1 張思維，陳萬(wàn)青，孔靈芝，等.中國(guó)部分市縣1998-2002年惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡.中國(guó)腫瘤，2006，15:430-448.

2 Jemal A，SiegeI R，Wand E，et al.Cancer Statistics 2008.CA Cancer J Clin 2008，58:71-96.

3 Kato N，Tamura G，F(xiàn)ukase M，et al.Hypermethylation of the RUNX3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants.Am JPathol，2003，163:872391.

4 Li QL，Ito，Sakaura C，et al.Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer.Cell，2002，109:113-124.

5 Miyazono K，Maeda S，Imamura T.Coordinate regulation of cell growth and differentiation by TGF-βsuper family and Runx Proteins.Oncongene，2004，23:4232-4237.

6 Tto Y，Miyazono K.Runx transcription factors as key targets of TGF-bet Superfamily signaling Curr OPin Genet Dev，2003，13:43-47.

7 Miyasono K，Suzuki H，Imamura T.Regulation of TGF-beta signaling and its roles in progression of tumors.Cancer Sci，2003，94:230-234.

8 Ito Y，Miyazono K.RUNX transcription factors as key targets of TGF-beta superfamily signaling.Curr Opin Genet Dev，2003，13:43-47.

9 Takeda M，Mizuide M，Oka M，et al.Interaction with Smad4 is indispensable for suppression of BMPsignaling by c-Ski.Mol Biol Cell，2004，15:963-972.

10 Nomoto S，Kinoshita T，Mori T，et al.Adverse prognosis of epigeneticinactivation in RUNX3 gene at 1p36 in human pancreatic cancer.Br J Cancer，2008，98:1690-1695.

11 Min B，Kim MK，Zhang JW，et al.Identification of RUNX3 as a component of the MST/Hpo signaling pathway.JCell Physiol，2011.［Epub ahead of print］