王菲菲，郝利民，，* ，王宗臻，任忠義，牛 爽，王啟志，魯吉珂，5，賈士儒

(1.天津科技大學，工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室，天津300457;2.總后勤部軍需裝備研究所，北京100010;3.寧波宜科科技實業(yè)股份有限公司，浙江寧波315153;4.北京九發(fā)藥業(yè)有限公司，北京102308;5.鄭州大學生物系，河南鄭州450001)

自由基(free radical)是生物體在新陳代謝過程中產生的一類具有高度氧化活性的帶有一個或幾個不配對電子的分子或原子，主要包括超氧陰離子和羥自由基等。正常情況下，機體內自由基的產生與消亡處于動態(tài)平衡，當這一平衡被打破時即會發(fā)生氧化應激，自由基會攻擊機體，造成脂質、蛋白質和DNA等生物大分子損傷，進而引發(fā)一系列疾?。?-2］。高強度軍事作業(yè)和劇烈體育運動會使機體處于缺血和缺氧狀態(tài)，機體氧化作用加強，自由基數(shù)量急劇上升，進而引發(fā)連鎖反應，破壞細胞結構，引起脂質過氧化，導致機體氧化損傷。氧自由基還會引發(fā)疲勞、延遲性肌肉酸痛、運動性貧血和血紅蛋白尿等，影響部隊的戰(zhàn)斗力和軍事作業(yè)能力。抗氧化劑能清除自由基，其作用可通過優(yōu)先被氧化，或對氧化損傷進行修復從而發(fā)揮保護作用。真菌多糖作為一種天然生物大分子，因其藥食用功效廣泛，安全無毒，受到越來越多的關注［3］，有望替代化學合成類抗氧化劑。例如，靈芝子實體多糖、冬蟲夏草菌絲體胞內多糖、紅菇胞外多糖等均具有很強的體外抗氧化活性［4-6］。云芝隸屬于擔子菌亞門，層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、云芝屬［7］。云芝在我國被廣泛用于癌癥和免疫缺陷等疾病的治療，被民間視為治病神藥［8］。研究表明，云芝多糖還具有顯著的抗氧化活性，對超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有顯著的清除作用［9-10］。目前，關于云芝總發(fā)酵物抗氧化活性方面的報道較少。本文通過考察云芝總發(fā)酵物及其多糖對氧化損傷酵母的保護作用，結合清除自由基能力，對云芝總發(fā)酵物抗氧化活性進行研究，可為云芝發(fā)酵物的開發(fā)利用提供參考，也可為云芝抗氧化保健食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云芝［Coriolus versicolor(L.:Fr.)］總后勤部軍需裝備研究所;釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)AS2399 天津科技大學菌種包藏室;濃硫酸 天津市元立化工有限公司，分析純;苯酚 北京鼎國生物技術有限責任公司，分析純;95%乙醇 天津市四通化工廠，分析純;葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、水楊酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、VC天津北方天醫(yī)化學試劑廠，分析純;鹽酸 天津化學試劑三廠，分析純;過氧化氫 天津市風船試劑科技有限公司，分析純。

電子天平JH1102、分光光度計722s 上海精密科學儀器有限公司;托盤天平HCTP11B5北京醫(yī)用天平廠;旋轉蒸發(fā)儀RE-3000 上海亞榮生化儀器廠;臺式高速離心機TGL16G 上海醫(yī)用分析儀器廠;pH計PHSJ-4A 上海雷磁儀器廠;電熱鼓風干燥箱DDG-101-3 天津天宇機電有限公司;恒溫搖床培養(yǎng)箱HYG 上海欣蕊自動化設備有限公司;超凈工作臺VS-1300V 蘇州安泰空氣技術有限公司;壓力蒸汽滅菌鍋LS-B50L型 上海醫(yī)用核子儀器廠;5升離位滅菌玻璃發(fā)酵罐 上海百侖生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 云芝總發(fā)酵物的制備 在林曉霞等［11］的方法基礎上改進，即利用基礎培養(yǎng)基(葡萄糖3.00%，蛋白胨 0.40%，KH2PO40.10%，MgSO40.05%)，在150mL/500mL，28℃，160r/min條件下，云芝液體培養(yǎng)6d，將菌體過濾，收集發(fā)酵液，利用旋轉蒸發(fā)儀將發(fā)酵液濃縮。

1.2.2 云芝多糖的制備 在王俊明等［12］的方法基礎上改進，即將上述云芝發(fā)酵液濃縮物以三倍95%乙醇沉淀，4℃下醇析12h，收集沉淀物，即為云芝多糖。

1.2.3 酵母細胞懸浮液的制備 取培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母細胞培養(yǎng)液于4000r/min離心5min，然后將菌體混懸于100mmol/L(pH7.4)的磷酸緩沖液中，細胞濃度為1 ×107～2 ×107個/mL［13］。

1.2.4 超氧陰離子(O2-·)清除能力測定 取濃度為50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL，蒸餾水4.5mL混勻，加25℃預熱的25mmol/L鄰苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl配制)，迅速搖勻后倒入比色皿，325nm下每隔30s測定吸光度值，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加。空白用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚，樣品管加鄰苯三酚前加樣液1mL，蒸餾水補充體積，同樣方法設VC陽性對照。每個樣3次平行取平均值［14］。清除率的公式如下:

式中，A0為鄰苯三酚自氧化速率，A為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率，單位為吸光度每分鐘的增加值。

1.2.5 羥自由基的清除能力測定 各試管中加入不同濃度樣液 2mL，9mmol/L水楊酸-乙醇 2mL，9mmol/L FeSO42mL，最后加入8.8mol/L的H2O22mL啟動反應，37℃反應30min。蒸餾水作為空白對照，在510nm下測量各待測液的吸光度?？紤]到樣品本身的吸光值，同樣條件用雙蒸水代替H2O2為本底吸收［15］。清除率的公式如下:

式中，A0為空白對照液吸光度，Ax為加入樣品后吸光度，Ax0為不加H2O2的樣品溶液本底吸光度。

1.2.6 氧化應激 酵母細胞懸液中添加云芝總發(fā)酵物，經過一段時間溫浴，在前期實驗確定致死劑量的基礎上，以終濃度為2%的H2O2或20W紫外燈30cm處照射60s(酵母存活率＜5%)兩種條件處理5mL的細胞懸液，采用平板活菌計數(shù)法，稀釋到適當濃度，涂布于YEPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2d。存活率通過與對照(相同條件下未處理樣品的菌落數(shù))相比而獲得［13］。

2 結果與討論

2.1 自由基清除能力測定

2.1.1 超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力測定 清除超氧陰離子自由基的結果如圖1所示。云芝總發(fā)酵物及其多糖均對超氧陰離子自由基具有明顯的清除率，且在0.1～0.5mg/mL的多糖濃度范圍內呈一定量效關系，云芝總發(fā)酵物清除效果最為顯著，高于云芝多糖樣品。經EC50計算得知，云芝總發(fā)酵物EC50值為0.34mg/mL，云芝多糖為0.35mg/mL，而 VC為0.28mg/mL。

圖1 云芝總發(fā)酵物及其多糖對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effects of the fermentation products ofCoriolus versicolor and its polysaccharide on superoxide ion radicals

2.1.2 羥自由基清除能力測定 清除羥自由基實驗結果如圖2所示。云芝總發(fā)酵物及其多糖均對羥自由基具有明顯的清除率，且在0.1～0.5mg/mL的多糖濃度范圍內呈一定量效關系。其中，云芝總發(fā)酵物清除羥自由基的效果最為顯著，在0.1～0.5mg/mL的濃度范圍內均高于云芝多糖，且在0.1～0.4mg/mL濃度范圍內的清除能力明顯高于VC。經EC50計算得知，云芝總發(fā)酵物 EC50值為 0.13mg/mL，而 VC為0.25mg/mL，是前者的2倍(p＜0.05有顯著性差異)，云芝多糖為0.16mg/mL，說明云芝總發(fā)酵物對羥自由基表現(xiàn)出較強的清除作用，優(yōu)于云芝多糖和VC。

圖2 云芝總發(fā)酵物及其多糖對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effects of the fermentation products ofCoriolus versicolor and its polysaccharide on hydroxyl free radicals

超氧陰離子自由基和羥自由基是活性氧自由基的典型代表，前者可通過轉化為其他多種有破壞作用的自由基而使其功能放大。在所有活性氧自由基中，羥自由基毒性最強，幾乎能與所有的功能性生物大分子起反應，造成生物體的巨大傷害［16］。從本實驗結果看，云芝總發(fā)酵物及其多糖對超氧陰離子自由基和羥自由基均具有明顯的清除能力。這為云芝總發(fā)酵物及其多糖在保健食品和藥物領域的應用提供依據(jù)。

2.2 云芝總發(fā)酵物對酵母氧化損傷的保護效應

云芝總發(fā)酵物對氧化損傷酵母細胞的保護作用如圖3、圖4所示。酵母細胞的存活率隨著云芝總發(fā)酵物和VC添加劑量的增加而升高，說明前者對細胞H2O2以及紫外線氧化損傷的保護作用有劑量依賴性(相關系數(shù)分別為R=0.99和R=0.95)。當云芝總發(fā)酵物多糖濃度為1.5mg/mL時H2O2氧化損傷酵母細胞存活率為46%，是VC(34%)的1.4倍，且明顯高于空白對照組;當云芝總發(fā)酵物多糖濃度為20mg/mL時，紫外氧化損傷細胞存活率為35%，與VC持平，明顯高于空白對照組。

圖3 云芝總發(fā)酵物對H2O2處理下酵母氧化損傷細胞的保護作用Fig.3 Protective effects of the fermentation products by Coriolus versicolor on oxidative damaged yeast cells under H2O2treatment

圖4 云芝總發(fā)酵物對紫外線照射處理下酵母氧化損傷細胞的保護作用Fig.4 Protective effects of the fermentation products byCoriolus versicolor on oxidative damaged yeast cells under UV irradiation

酵母細胞內的水經紫外線照射后會產生多種活性氧，如 O3、·OH、O2-·等。和·OH、O2-·一樣，O3也是進攻生物分子的強氧化劑，可以氧化蛋白質的胱氨酸和組氨酸，氧化不飽和脂肪酸導致脂質過氧化，致使酵母細胞大量死亡。云芝總發(fā)酵物可以顯著提高其存活率，較云芝多糖表現(xiàn)出更強的抗氧化能力。

2.3 云芝總發(fā)酵物與其他天然抗氧化活性成分對酵母細胞氧化損傷保護作用的對比

分別將云芝總發(fā)酵物(Y)及其多糖溶液(Yp)、茯苓總發(fā)酵物(F)及其多糖溶液(Fp)、大球蓋菇總發(fā)酵物(D)、槲皮素(H)、VC(C)配成20mg/mL的溶液，進行酵母細胞紫外線氧化損傷保護實驗，結果如圖5所示。

由圖5可以看出，添加云芝總發(fā)酵物的氧化損傷酵母細胞存活率達到47.4%，其抗氧化效果優(yōu)于云芝多糖溶液和其他兩種真菌發(fā)酵物及槲皮素。

云芝總發(fā)酵物的抗氧化活性優(yōu)于云芝多糖，原因之一可能是云芝總發(fā)酵物中除了多糖外，還有其他抗氧化活性組分，不同化合物具有協(xié)同增效作用;原因之二可能是在多糖制備中，乙醇醇析等操作引起多糖空間結構變化，從而導致云芝多糖的抗氧化活性降低。

圖5 云芝總發(fā)酵物與其他天然抗氧化活性成分對酵母細胞氧化損傷保護作用的對比Fig.5 Comparison of the protective effect of the fermentation products by Coriolus versicolor and other natural antioxidant components on oxidative damaged yeast cells

3 結論

云芝總發(fā)酵物及其多糖對超氧陰離子自由基和羥自由基均具有明顯的清除能力。云芝總發(fā)酵物對經過H2O2和紫外照射兩種氧化應激處理下的酵母細胞具有顯著的保護作用，且呈劑量依賴性。云芝總發(fā)酵物的抗氧化活性優(yōu)于云芝多糖以及其他兩種真菌發(fā)酵物。下一步應對云芝總發(fā)酵物化學組成進行研究，進而闡明云芝總發(fā)酵物的抗氧化作用機理。

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