王迎寒，周淑媛，鞏仔鵬，楊 慶，王婭杰，朱曉新△

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700;2.承德醫(yī)學院，河北承德 067000)

戊己丸源于《太平惠民和濟局方》，由黃連、吳茱萸和白芍組成。其中黃連為君，味苦性寒，善清火燥濕;白芍味酸甘，入肝經，可柔肝緩急、健脾益氣，為臣;吳茱萸辛熱，溫中健脾開郁并引熱下行，三藥合用共奏疏肝理脾、健脾和胃之功，符合中醫(yī)治療脾胃病以“健脾祛濕以運中焦、調肝理氣以暢氣機”的治療大法［1］，為治療肝脾不和所致腹痛泄瀉的常用方劑，臨床中常用于治療胃腸道炎癥及腸易激綜合征(IBS)。胃腸動力障礙是IBS的主要病理生理之一，至今仍備受關注。隨著科研方法和研究手段的不斷進步，對于胃腸運動的研究已經從在體運動和離體肌電、肌動的宏觀水平深入到單個細胞、細胞器甚至分子水平。平滑肌細胞是胃腸運動的基本單位，也是研究胃腸運動的靶細胞。

前期實驗中我們發(fā)現，戊己丸不同配伍方能改善炎癥后IBS(PI-IBS)模型大鼠的結腸運動，其作用機制可能與參與調節(jié)結腸和中樞邊緣系統(tǒng)內5-羥色胺(5-HT)含量，以及 5-HT 3，4受體(5-HT 3，4 R)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+含量有關。但由于在體胃腸運動受到諸多神經及其遞質的調節(jié)，機制非常復雜。因此，本實驗擬采用分離培養(yǎng)的大鼠結腸平滑肌細胞在離體狀態(tài)下，以5-HT 3，4R為切入點，戊己丸不同配伍方對胃腸運動的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD雄性SPF級大鼠，體質量250～300g，購于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所(SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 試劑及儀器 (1)主要試劑:大豆胰蛋白酶抑制劑(批號 T6522)、Ⅱ型膠原酶(批號C6885)、高糖 DMEM(批號 12100-046)、小牛血清(批號 00548)、HTR3A antibody(批號 GTX85866)Flou 3A熒光探針(批號20071101)、α-actin(批號bs-0189R)、兔 Streptavidin-HRP試劑盒 (批號CW2035)、5-HT4 receptor antibody(批 號GTX30983)、山羊抗兔IgG(H+L)DyLight649(批號CW0232)、大鼠 cAMP酶聯免疫試劑盒(批號F15181)、大鼠 PKA酶聯免疫試劑盒(批號F16577)、HEPES Ringer緩沖液(每1L中含HEPES 5.839g，NaCl 5.902 g，KCl 0.969 g，NaH2PO40.39 g，CaCl20.2 g，MgCl20.24 g，谷胺酸鈉 0.936 g，谷胺酰胺 0.292 g，葡萄糖 2.279 g，BSA 1 g，pH 至7.2，過濾除菌);(2)主要儀器:SORVALL LEGEND RT+冷凍高速離心機(Thermo SCIENTIFIC)、CKX41倒置顯微鏡(OLYMPUS)、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、MCO-20AICCO2INCUBATOR(SANYOElectric CO.，Ltd)、FV1000 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡(OLYMPUS)、IX81 倒置顯微鏡(OLYMPUS)、ELX800型酶標儀(BIO-TEK INSTRUMENTS，INC)。

1.1.3 藥物 苯基雙胍(B)(批號P1002)、阿洛司瓊(A)(批號sc-210788)、替加色羅(T)(批號sc-212993)、GR113808(GR)(批 號 G5918)、SQ22536(SQ)(批號 S153)、Forskolin(F)(批號F6886)、戊已丸提取物:黃連、制吳茱萸、炒白芍飲片購自北京衛(wèi)仁飲片廠，并經中國中醫(yī)科學院中藥研究所鑒定，黃連醇提物、吳茱萸醇提物、白芍水提物由中日友好醫(yī)院劑型室按照優(yōu)選工藝分別進行提取;將單味藥按L9(34)正交表(黃連、吳茱萸、白芍各有3個劑量水平交互配比成戊己丸9個不同配伍方)，以黃連、吳茱萸及白芍的比例分別為12∶2∶3，12∶1∶12 為受試的1 號方(W1)和2 號方(W2)［2］。

1.2 方法

1.2.1 結腸平滑肌的分離、培養(yǎng)及鑒定 參考Bitar方法［3］，每次取2只大鼠分離結腸平滑肌細胞，Trypan藍染色法檢查細胞活性，確認活細胞在90%以上。調細胞濃度至5×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37℃ 95%O2和5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后換液，以后每3 d更換培養(yǎng)基1次，期間用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。10d左右，細胞長滿90%培養(yǎng)瓶底時按1∶3比例傳代。并取原代細胞進行爬片，行α-actin免疫組織化學染色［4］。

1.2.2 戊己丸儲備液的配制 1號方提取物(黃連0.1927 g，吳茱萸0.0294 g，白芍0.02335 g)和2號方提取物(黃連0.1927 g，吳茱萸0.0147 g，白芍0.0934 g)溶于雙蒸水中，DMSO助溶，均定容至10 mL，4℃保存，臨用時用無血清的培養(yǎng)基稀釋到0.62 g/L和0.75 g/L，過濾除菌后應用。

1.2.3 觀察指標 (1)免疫熒光法檢測大鼠結腸平滑肌細胞5-HT 3，4R:收集第2代平滑肌細胞，消化后調細胞濃度為5×105/mL，接種于預先放置蓋玻片的24孔板中爬片。2d后換新鮮培養(yǎng)基，同時加入1號方或2號方溶液和工具藥(B或A或T 或 GR，12.5μg/mL)溶液各50μL，同時設空白、工具藥及戊己丸對照孔，每孔總體積為500μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。免疫熒光染色主要步驟:取出細胞爬片，用PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定，正常山羊血清封閉;一抗孵育(5-HT3R或5-HT4R，1∶100)，4℃過夜，PBS 洗;熒光二抗(1∶100)37℃避光孵育60 min，PBS洗;蒸餾水漂洗1次封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。每張片子隨機取3～5個視野并拍照，用軟件FV1000計算熒光強度;(2)激光共聚焦顯微鏡檢測大鼠結腸平滑肌細胞內游離Ca2+濃度:取第2代平滑肌細胞，消化后調細胞濃度為1×105/mL，接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2mL，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，貼壁后加入1號方或2號方，繼續(xù)培養(yǎng)12h，PBS洗3次，加入4μmol/L的 Fluo-3/AM 工作液，37℃培養(yǎng)20min，再加入5倍體積含1%胎牛血清的HBSS，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，PBS洗3次，皿中留1 mL PBS待測。激光共聚焦顯微鏡下，488nm，20倍掃描成像，每個樣本掃描加入刺激劑前及加入刺激劑5 min時的圖像，比較熒光強度變化，以熒光強度表示胞內游離鈣的水平。刺激劑分別為A、B、T和GR，終濃度均為1.25μg/mL;(3)雙抗夾心法檢測大鼠結腸平滑肌細胞內cAMP，PKA濃度:第2代平滑肌細胞消化后，調細胞濃度為5×105/mL，接種于96孔板中，每孔20μL，補足新鮮培養(yǎng)基，每孔總體積為200μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2d后每孔換新鮮培養(yǎng)基180μL，同時加入1號方或2號方溶液20μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。再加入工具藥(T或GR或F或SQ)，使工具藥的終濃度分別為1.25μg/mL、1.25μg/mL、1 nmol/mL、0.5 nmol/mL，培養(yǎng) 0.5h。同時設空白對照、工具藥及戊己丸對照孔，每個藥物均設3個復孔，重復3次。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)上清，PBS洗3次，然后每孔加入 PBS 200μL，反復凍融3次，－80℃保存。采用雙抗夾心法進行檢測cAMP和PKA濃度。

2 結果

2.1 大鼠結腸平滑肌的培養(yǎng)及鑒定

如圖1、2所示，在培養(yǎng)10d左右，原代培養(yǎng)的大鼠結腸平滑肌細胞呈梭型，排列緊密，生長狀態(tài)良好。經α-actin免疫組化鑒定，分離培養(yǎng)的細胞胞漿內分布大量黃色顆粒(圖4)，而陰性對照細胞胞漿內無著色(圖3)，分離培養(yǎng)的細胞鑒定為大鼠結腸平滑肌細胞。

2.2 戊己丸不同配伍方對平滑肌細胞5-HT 3，4R 的影響

表1顯示，與NC組比較，1號方和2號方均可顯著降低5-HT3R熒光強度(P＜0.01)。經A和GR處理后，5-HT 3，4R熒光強度明顯增高;兩方均可使其顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。經B和T處理后，5-HT 3，4R熒光強度明顯降低，兩方均能顯著促進其下降(P＜0.05，P＜0.01)，1號方和2號方 之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖1 培養(yǎng)10d左右的SMC(×10)

圖2 培養(yǎng)10d左右的SMC(×20)

圖3 陰性對照(×20)

圖4 SMC α-actin 組化染色(×20)

表1 平滑肌細胞5-HT 3，4R表達比較(±s)

表1 平滑肌細胞5-HT 3，4R表達比較(±s)

注:與 NC組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01;與 W1組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01(下同)

R組別5-HT3 5-HT4R 26 W1 935.92±108.52＊＊ 1434.61±56.07* 676.59±54.67＊＊ 1193.72±73.23＊＊ 987.47±93.99* 1544.54± 68.67＊＊W2 777.19± 76.74＊＊△ 1336.48±34.34＊＊△ 574.73±60.77＊＊△△ 1093.41±64.84＊＊△ 809.37±97.90＊＊△△ 1419.57± 84.04 GR NC 1250.77± 89.49 1596.64±99.41 802.79±45.59 1371.56±95.33 1125.51±76.22 1776.07±110.無工具藥 A B 無工具藥T＊＊△

2.3 戊己丸不同配伍方對平滑肌細胞內游離Ca2+的影響

表2顯示，1號方和2號方均可使大鼠結腸平滑肌細胞內Ca2+濃度顯著下降(P＜0.01)。經A和GR處理后，Ca2+濃度均顯著下降，兩方均可顯著促進其下降(P＜0.01)。經B和T處理后，Ca2+濃度均顯著升高，兩方均可使其明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，1號方和2號方之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 平滑肌細胞內游離Ca2+比較(±s)

表2 平滑肌細胞內游離Ca2+比較(±s)

組 別 無工具藥.01±10.86 161.42±7.02 W1 151.05±6.55＊＊ 128.11±5.64＊＊ 220.31±11.72＊＊ 221.35±14.39* 142.14 ±5.80＊＊W2 136.90±4.02＊＊△ 113.56±2.39＊＊△ 198.05± 7.14＊＊△ 193.90±12.44＊＊△ 121.02 ±5.26 GR NC 181.42±8.77 150.71±8.64 254.61±12.94 260 A B T＊＊△△

2.4 戊己丸不同配伍方對平滑肌細胞內cAMP、PKA 的影響

表3、4顯示，1號方和2號方均可使平滑肌細胞內cAMP和PKA顯著下降(P＜0.01)。經T和F處理后，cAMP和PKA均顯著升高，兩方均可使其明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。經GR和SQ處理后，cAMP和PKA均顯著降低，兩方均可明顯促進其下降(P＜0.05，P＜0.01);1號方和2號方之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 平滑肌細胞內cAMP的比較(pmol/mL，±s)

表3 平滑肌細胞內cAMP的比較(pmol/mL，±s)

組 別 無工具藥8.17±0.46 W1 8.17±0.59＊＊ 11.50 ±0.48＊＊ 7.51±0.18＊＊ 11.56±0.30＊＊ 7.67±0.34*W2 7.31 ±0.59＊＊△ 10.22 ±0.44＊＊△△ 6.76 ±0.37＊＊△△ 9.68 ±0.64＊＊△△ 6.78 ±0.40 GR F SQ NC 9.41±0.32 13.07±0.68 8.29±0.19 13.78±0.53 T＊＊△△

表4 平滑肌細胞內PKA的比較(pg/mL，±s)

表4 平滑肌細胞內PKA的比較(pg/mL，±s)

組 別 無工具藥.91 15.83±1.71 W1 15.28±1.91＊＊ 37.39 ±3.37＊＊ 13.82±1.14＊＊ 33.19±2.15* 12.35±2.03＊＊W2 12.63 ±2.26＊＊△ 31.45 ±3.50＊＊△△ 11.07 ±1.54＊＊△△ 28.43 ±1.68＊＊△△ 10.07 ±1.28 GR F SQ NC 20.30±1.95 46.43±3.12 16.65±1.46 42.41±4 T＊＊△

3 討論

5-HT3受體是陽離子通道受體，5-HT4受體是G蛋白偶聯受體，兩者均廣泛分布于胃腸道的黏膜層、肌層和腸神經系統(tǒng)，可由5-HT激活，參與胃腸運動的調節(jié)。越來越多的研究表明，腸易激綜合征患者5-HT 3，4受體表達異常，是腸易激綜合征的發(fā)病機制之一。本實驗中戊己丸不同配伍方在離體狀態(tài)下可抑制5-HT 3，4受體的表達，從而拮抗5-HT 3，4受體介導的胃腸運動加快，這可能是其改善PIIBS大鼠結腸運動的作用機制之一。目前的研究報道雖未查到戊己丸及其組分可下調5-HT 3，4受體表達的報道，但其作用卻是真實存在的。

Ca2+在介導平滑肌收縮反應中起核心作用，其濃度的升高依賴于胞外Ca2+內流或胞內貯存Ca2+釋放。胞外Ca2+內流起主要的作用，通過電壓門控鈣通道、鈣庫調控性鈣通道和受體操縱性鈣通道3種方式介導［5］，但起主要作用的是電壓門控鈣通道，尤其是 L-型鈣通道［6，7］。5-HT 作用于 3、4 受體后均可激活L-型電壓門控鈣通道，使平滑肌細胞內Ca2+增多。戊己丸中小檗堿作為鈣通道拮抗劑，在抑制Ca2+內流上起重要作用;而戊己丸又可下調3、4受體的表達，使L-型電壓門控鈣通道的激活減少，Ca2+內流亦隨之減少，從而使胞內Ca2+濃度下降，平滑肌收縮減慢。

cAMP作為第二信使，其調控作用廣泛分布于胃腸道的黏膜層、肌層以及腸神經系統(tǒng)中，對胃腸道的運動、內臟感覺及分泌都具有非常重要的調節(jié)作用，可由AC活化而產生，進一步激活PKA，影響多種蛋白的磷酸化及離子通道的激活或失活，使細胞對外界刺激產生反應。5-HT4R的活化能使其增加。現代藥理研究表明，黃連、白芍及芍藥苷均能調節(jié)cAMP信號傳導通路［8～10］，說明戊己丸下調平滑肌細胞cAMP水平可能是其改善結腸運動的作用機制之一。

由此我們推測，在無神經和體液的干預下，戊己丸可以通過調節(jié)平滑肌細胞的5-HT 3，4R及cAMP水平，影響細胞的收縮舒張運動，此作用可能是其改善PI-IBS大鼠結腸運動的作用機制之一。在本實驗中，2號方的作用優(yōu)于1號方，其原因可能是兩方中吳萸和白芍的用量差別較大，而中藥復方療效不同于單味藥的相加，其作用隨方中用藥比例不同而有差異［11，12］。

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