王寶家，楊 宇，唐洪屈，鄭秀麗，商紹東，王恩成，陳云慧

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

“肺與大腸相表里”的理論源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》［1］，肺與大腸生理上相互依存，病理上相互影響，治療上相互為用。臨床可根據(jù)慢性肺疾病患者出現(xiàn)的證候，運(yùn)用通腑法治療肺部疾病取得顯著療效［2，3］。課題組前期研究成果提示，“肺病及腸”的主要病變部位是結(jié)腸［4，5］，故本研究觀察模型大鼠肺與結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化，檢測胃腸功能及肺腸組織內(nèi)皮素1(ET-1)含量并進(jìn)行相關(guān)性分析，以探討慢性支氣管炎大鼠結(jié)腸損害的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，體質(zhì)量200±20g，隨機(jī)分為正常組24只和模型組36只。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 (ET-1)Elisa試劑盒(RD公司)，天下秀香煙(川渝中煙工業(yè)公司)，煙熏箱(自制紙箱，550mm×330mm×390mm，對(duì)側(cè)頂端開孔3cm×8cm)，電子秤(ACS-3H型，中山市金利電子衡器有限公司制造)，高速低溫離心機(jī)(TGL-16G型，上?？茖W(xué)儀器廠)，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(DY89-Ⅱ型，寧波新芝生物科技有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HHS型，江蘇正基儀器有限公司)，Thermo移液器(ZX1437型，北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司)，ELx800吸收光酶標(biāo)儀(Biotek美國伯騰儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照前期研究用改良單純煙熏法造模［8］，正常組置常溫?zé)o煙室內(nèi)飼養(yǎng)(室溫25℃～26℃，相對(duì)濕度50%～70%;模型組大鼠置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，用自制煙熏箱罩住，點(diǎn)燃香煙置于鋼絲網(wǎng)上，每份8支，約15min香煙燃盡后放置第二批香煙，每次共24支香煙持續(xù)煙熏50min，每天3次(9點(diǎn)、14點(diǎn)和19點(diǎn))，共煙熏70d。

1.2.2 取材 在造模第20天、第50天、第70天分別隨機(jī)抽取正常組大鼠8只和模型組大鼠10只，以2.4%水合氯醛麻醉、頸椎脫臼處死，取左肺葉和結(jié)腸以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片(5μm)，行HE染色;取右肺葉和結(jié)腸(各約0.2g)勻漿，3000r/min離心 20min，取上清液 1.5ml于－85℃冰箱保存。

1.2.3 胃腸功能檢測方法 ①糞便干濕重、糞便含水率:分別在造模第19、49、69天(上午9點(diǎn))，收集各組大鼠24h糞便顆粒，稱重后予以記錄，將稱濕重后的糞便置于60℃遠(yuǎn)紅外線快速恒溫干燥箱中干燥10h，稱重并予以記錄。糞便含水率(%)=(糞便濕重－糞便干重)/糞便濕重×100%;②胃內(nèi)殘留率與小腸推進(jìn)率:大鼠處死前禁食24h，用5%炭末與10%羧甲基纖維素鈉制成懸混液，各組大鼠以20ml·kg－1的劑量灌胃，30min 后以 2.4%水合氯醛1.2ml～1.4 ml/100g腹腔注射麻醉，取全胃沖洗后稱胃全重，清除胃內(nèi)容物后稱胃空重，胃內(nèi)殘留率(%)=(胃全重－胃空重)/胃全重×100%。打開大鼠腹腔分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，不加牽引平鋪于玻璃板上，測其全長和炭末前沿至幽門的距離，計(jì)算其與全長的百分比，即推進(jìn)百分率、小腸推進(jìn)率(%)=(炭末推進(jìn)距離)/小腸全長×100%。

1.2.4 組織ET-1含量檢測 取組織勻漿上清液100μL，按ELISA試劑盒(RD公司分裝)說明書操作，檢測肺、腸組織ET-1水平。采用ELx800吸收光酶標(biāo)儀在450nm處讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般表現(xiàn)

正常組大鼠毛色光澤，精神狀態(tài)、活動(dòng)度良好，無異常表現(xiàn)。模型組大鼠隨著造模時(shí)間延長逐漸出現(xiàn)毛色萎黃、不同程度地脫毛、精神不振、活動(dòng)減少、進(jìn)食減量、鼻腔分泌物增多、咳嗽、噴嚏等頻繁癥狀。

2.2 肺、結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察

正常組第20、50、70天肺和結(jié)腸組織均無顯著病理改變(見圖1～圖3)。模型組大鼠第20、50、70天肺和結(jié)腸組織出現(xiàn)病理改變的比率逐漸增加，分別為40%、70%和80%?？梢娭夤苌掀ぜ?xì)胞變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生，I型上皮細(xì)胞線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管基底膜增厚，肺泡壁纖維組織增生(見圖4);結(jié)腸黏膜及黏膜下炎細(xì)胞浸潤，部分微絨毛消失，線粒體腫脹，黏膜下固有層膠原纖維增生、見成纖維母細(xì)胞(見圖5、圖6)。

2.3 胃腸功能檢測結(jié)果

圖1 正常組70d肺組織(HE×100)

圖2 正常組70d結(jié)腸組織(HE×100)

圖3 正常組70d結(jié)腸組織(EM×700)

圖4 模型組70d肺組織(HE×100)

圖5 模型組70d結(jié)腸組織(HE×100)

圖6 模型組70d結(jié)腸組織(EM×700)

表1顯示，與正常組比較，第20天模型組大鼠胃內(nèi)殘留率顯著升高，小腸推進(jìn)率顯著降低(P＜0.01)，糞便含水率降低不顯著(P＞0.05);第50、70天模型組大鼠糞便含水率、小腸推進(jìn)率均顯著降低(P＜0.01)，胃內(nèi)殘留率顯著升高(P＜0.01)。模型組間比較，與第20天比較，第50、70天組大鼠糞便含水率、小腸推進(jìn)率均顯著降低(P＜0.01)，胃內(nèi)殘留率顯著升高(P＜0.05);與第50天比較，第70天組大鼠胃內(nèi)殘留率顯著升高(P＜0.01)，小腸推進(jìn)率顯著降低(P＜0.01)，糞便含水率顯著降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠第20、50、70天胃腸功能測定結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠第20、50、70天胃腸功能測定結(jié)果比較(±s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組第20天比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組第50天比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) 組 別 例數(shù) 糞便含水率 胃內(nèi)殘留率 小腸推進(jìn)率第20天 正常組＊＊△△▲▲8 0.63±0.09 0.32±0.03 0.85±0.04模型組 10 0.62±0.03 0.43±0.03＊＊ 0.73±0.05＊＊第50天 正常組 8 0.66±0.04 0.36±0.01 0.86±0.04模型組 10 0.49±0.06＊＊△△ 0.46±0.04＊＊△ 0.65±0.04＊＊△△第70天 正常組 8 0.63±0.02 0.37±0.02 0.85±0.04模型組 10 0.44±0.04＊＊△△▲ 0.52±0.03＊＊△△▲▲ 0.57±0.03

2.4 肺、結(jié)腸組織ET-1含量檢測結(jié)果

表2顯示，與正常組比較，第20天模型組鼠肺組織ET-1含量顯著升高(P＜0.01)，結(jié)腸組織ET-1含量升高不顯著(P＞0.05);第50、70天模型組大鼠肺、結(jié)腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01)。模型組間比較，與第20天比較，第50、70天組大鼠肺、結(jié)腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01);與第50天比較，第70天組大鼠肺、結(jié)腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01)。

2.5 慢支炎模型大鼠肺、結(jié)腸組織ET-1水平與胃腸功能各指標(biāo)相關(guān)性

表2 各組大鼠第20、50、70天肺和結(jié)腸組織ET-1含量結(jié)果比較(±s，ng/L)

表2 各組大鼠第20、50、70天肺和結(jié)腸組織ET-1含量結(jié)果比較(±s，ng/L)

注:與同時(shí)間點(diǎn)正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組第20天比較:△△P＜0.01;與模型組第50天比較:▲▲P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) 組 別 例數(shù) 肺組織ET-1含量 結(jié)腸組織ET-1含量第20天 正常組8 87.39±6.33 54.89±8.81模型組 10 110.53±4.57* 57.10±6.89第50天 正常組 8 84.32±8.61 52.14±5.89模型組 10 133.32±6.17＊＊△△ 77.79±5.13＊＊△△第70天 正常組 8 81.71±6.72 55.21±9.21模型組 10 154.67±5.26＊＊△△▲▲ 96.64±4.24＊＊△△▲▲

模型組大鼠肺組織ET-1含量與胃內(nèi)殘留率呈正相關(guān)(r=0.422，P=0.028)，與小腸推進(jìn)率呈負(fù)相關(guān)(r=－0.487，P=0.026);模型組大鼠結(jié)腸組織ET-1含量與胃內(nèi)殘留率呈正相關(guān)(r=0.459，P=0.017)，與小腸推進(jìn)率呈負(fù)相關(guān)(r=－0.487，P=0.026)，與糞便含水率呈負(fù)相關(guān)(r=－0.282，P=0.043);肺組織ET-1含量與結(jié)腸組織ET-1含量呈正相關(guān)(r=0.873，P=0.009)。

3 討論

慢性支氣管炎(簡稱“慢支炎”)是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，臨床以咳嗽、咳痰為主要癥狀。慢性支氣管炎屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽”范疇，主要病因病機(jī)為外感六淫、臟腑失調(diào)、邪犯于肺、肺氣上逆。肺與大腸相表里，肺氣以降為和，大腸以通為用。肺失宣降、腑氣不通則大腸傳導(dǎo)失施?！秴蔷贤ㄡt(yī)案·卷二》提到:“痰飲十?dāng)?shù)日，大便燥結(jié)，乃肺氣不降，肺與大腸相表里，肺氣痹則大腸亦痹。［6］”肺病治腸的理法方藥古已有之，如《傷寒論》242條:“喘冒不得臥者，有燥屎也，宜大承氣湯?！?/p>

內(nèi)皮素是由內(nèi)皮細(xì)胞合成的具有強(qiáng)烈縮血管作用活性的內(nèi)源性肽類物質(zhì)，最早由日本學(xué)者Yanagisawa等［7］從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離純化出來，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。內(nèi)皮素有3種異構(gòu)體，而活性最強(qiáng)的內(nèi)皮素1(ET-1)可以使支氣管收縮，增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞的超常增生和增殖，且上調(diào)炎癥反應(yīng)。ET-1還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原蛋白基因Ⅰ和膠原蛋白基因Ⅲ的表達(dá)，促進(jìn)膠原蛋白沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化［8］。ET不僅可由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，也可由胃腸道黏膜上皮細(xì)胞合成，ET-1可致大鼠小腸黏膜下血管白細(xì)胞黏附［9］。ET-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以使小腸黏膜下微小血管收縮，毛細(xì)血管通透性增加，組織水腫、血流量減少，最終引起腸道局部缺血缺氧，組織損傷［10］。

慢性支氣管炎的發(fā)病與吸煙、大氣污染、感染、氣候寒冷以及機(jī)體內(nèi)在因素均有關(guān)，其中吸煙是公認(rèn)的最重要引起發(fā)病外因。煙草中含焦油、尼古丁和氫氰酸等化學(xué)物質(zhì)，可損傷氣道上皮細(xì)胞，使支氣管黏液腺肥大、支氣管黏膜充血水腫、黏液聚集，還可使氧自由基產(chǎn)生增多，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶，誘發(fā)肺氣腫形成［11］。煙熏法能較好模擬人類慢性支氣管炎的發(fā)病過程，且造模容易成功。課題組前期研究表明，無香煙品牌特異性干擾因素［4、5］，故本次實(shí)驗(yàn)采用改良單純煙熏法建立大鼠慢支炎模型。研究結(jié)果顯示，慢支炎大鼠肺組織ET-1含量顯著高于正常組，慢支炎大鼠出現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤可能與ET-1促進(jìn)炎癥反應(yīng)有關(guān)。肺泡上皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管基底膜增厚、肺泡壁纖維組織增生可能與ET-1促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原蛋白基因表達(dá)有關(guān)。模型組大鼠第20、50、70天肺組織ET-1含量逐漸升高，說明隨著煙熏干預(yù)時(shí)間延長，模型組大鼠肺組織損傷越嚴(yán)重。第50、70天慢支炎大鼠結(jié)腸組織ET-1含量顯著高于正常組，結(jié)腸黏膜及黏膜下炎細(xì)胞浸潤、部分微絨毛消失、線粒體腫脹、黏膜下固有層膠原纖維增生、見成纖維母細(xì)胞等，其損害可能與ET-1介導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。慢支炎大鼠第20天結(jié)腸組織ET-1含量較正常組升高不顯著，普通光鏡和電鏡觀察結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤不明顯，未引起結(jié)腸損傷。模型大鼠胃腸功能與肺腸組織ET-1含量有相關(guān)性，主要表現(xiàn)在胃內(nèi)殘留率升高和小腸推進(jìn)率降低，可能與大鼠胃腸損害導(dǎo)致胃排空及腸蠕動(dòng)功能減弱有關(guān)。隨著干預(yù)時(shí)間延長，結(jié)腸組織ET-1含量逐漸升高，與肺組織ET-1含量呈顯著正相關(guān)，且結(jié)腸組織病理損害漸趨嚴(yán)重，提示“肺病及腸”的病理傳變與肺部病變的時(shí)間和程度相關(guān)，ET-1可能是介導(dǎo)慢支炎發(fā)生結(jié)腸病理損害的基礎(chǔ)物質(zhì)之一。

［1］田代華.黃帝內(nèi)經(jīng)素問［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:3.［2］傅理均，倪建江.淺談通便在肺系病癥中的應(yīng)用［J］.江西中醫(yī)藥，2007，38(4):16-17.

［3］呂建民.瀉下法治療肺部疾病［J］.新中醫(yī)，2007，39(2):14-15.

［4］惠毅，楊宇，張顯明，等.從“肺腸合病”模型大鼠血清TNF-α、IL-1含量變化探討“肺與大腸相表里”［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(1):153-154.

［5］唐宇姣，楊宇，惠毅，等.“肺病及腸”動(dòng)物模型建立的探索［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(8):38-40.

［6］清·吳塘.吳鞠通醫(yī)案［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2010:4.

［7］Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstrictor Peptide produced by vascular endothelial cells［J］.Nature，1988，332(6163):411-415.

［8］Kulasekaran P，Scavone CA，Rogers DS，et al.Endothelin-1 and transforming growth factor-beta1 independently induce fibroblast resistance to apoptosis via AKT activation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2009，41(4):484.

［9］Yu W，Lin Z，Hegarty JP.Genes regulated by Nkx2-3 in siRNA-mediated knock down B cells implication of endothelin-1 in inflammatory bowel disease［J］.Mol Genet Metab，2010，100(1):88-95.

［10］Schnabl KL，Larsen B，Van Aerde JE，et al.Gangliosides protect bowel in an infantmodelofnecrotizing enterocolitis by suppressing proinflammatory signals［J］.Pediatr Gastroenterol Nutr，2010，51(5):687.

［11］Pelkonen M.Smoking:relationship to chronic bronchitis，chronic obstructive pulmonary disease and mortality［J］.Curr Opin Pulm Med，2008，14(2):105.