張 虎，杜欣娜，張淑紅，朱金玲，李春明，趙 璐，胡新俊

（1.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154002；3.佳木斯中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154002）

干擾素（Interferon，IFN）主要是糖蛋白，功能多樣，具有免疫活性。干擾素在抗病毒、增強免疫力和治療腫瘤方面作用巨大。一直以來干擾素一直是生命科學領(lǐng)域的研究重點和熱點。但是在臨床上，干擾素的不足之處在于半衰期短，且容易產(chǎn)生副作用。尋找合適的干擾素誘導(dǎo)劑成為了當今研究的焦點[1]。本課題研究了新鮮香菇dsRNA對于小鼠肝臟細胞的干擾素－α的表達影響，初步探討其中的機制，為尋找合適的干擾素誘導(dǎo)劑提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

佳木斯大學動物中心提供小鼠30只，體重（20±4）g，隨機分為對照組和實驗組。新鮮香菇購買于佳木斯市大潤發(fā)超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 DsRNA的提取和鑒定

[2，3]，取新鮮香菇10g，液氮研磨，加入2倍體積的STE及酚／氯仿／異戊醇混合液抽提；2000rpm離心；取上清液，加入無水乙醇至終濃度的17%，注入預(yù)處理過的纖維素（CF－Ⅱ）柱中，最后用80mL含17%乙醇的1倍體積的STE液洗脫，再用不含乙醇的1倍體積的STE液洗脫；洗脫液用異丙醇、乙醇沉淀，真空抽干，得到dsRNA。

1.2.2 RT－PCR檢測干擾素－αmRNA的表達變化

1.2.2.1 動物處理

對照組小鼠不做任何處理，實驗組小鼠分為dsRNA注射0.5、5和50mg·kg－1三個組，12h后猝死所有小鼠，取肝臟，液氮保存，備用。

1.2.2.2 小鼠肝臟總RNA提取

TRIZOL法提取總RNA，操作步驟完全按照Invitrogen公司的說明書進行。

1.2.2.3 RT－PCR檢測干擾素－αmRNA的表達

① 反轉(zhuǎn)錄：依據(jù)試劑盒說明書20μL反應(yīng)體系：

總RNA：2μg；10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液：2μL；100mM dNTP：0.8μL；10×反轉(zhuǎn)錄隨機引物：2μL；50u／μL反轉(zhuǎn)錄酶：1μL；40u／μL RNA酶抑制劑：0.5μL；DEPC處理過的去離子水：補至20μL。

反轉(zhuǎn)錄條件：25℃10min，37℃120min，85℃5sec，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA－20℃保存待用。

②PCR擴增：IFN－α引物序列：上游5＇CTGTGCTTTCCTGATGGT 3＇，下游5＇GAGTCTAGGAGGGTTGTATT 3＇，產(chǎn)物大?。?09bp；

GAPDH引物序列：

上游5’GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3’，

下游5’AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC 3’，產(chǎn)物大小：700bp。

PCR反應(yīng)體系（20μL）：cDNA：1μL；2×Mix液：10μL；F P：0.5μL；R P：0.5μL；無菌雙蒸水：補至20μL

PCR反應(yīng)條件：

95℃5min，95℃30sec，56℃30sec，72℃50sec，28個循環(huán)，72℃5min.

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，計量資料以±s表示，P＜0.05表示差異具顯著。

表1 不同組間干擾素－αmRNA表達變化（n＝6，±s）

表1 不同組間干擾素－αmRNA表達變化（n＝6，±s）

注：＊P＜0.01vs對照組；＃P＜0.01vs 0.5mg·kg－1；＆P＜0.01vs 5mg·kg－1

指 標 對照組 0.5mg·kg－1 5mg·kg－1 50mg·kg－1干擾素－αmRNA 0.34±0.05 0.56±0.08＊ 0.73±0.11＊＃ 0.61±0.09＊＆

2 結(jié)果

見表1。

3 討論

1957年人們首次發(fā)現(xiàn)干擾素，生物學活性廣泛，具有廣譜的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用，組成了機體防御的重要部分。IFN－α不能直接清除宿主病毒，而是通過抑制病毒復(fù)制來完成抗病毒作用，所以臨床上一旦停止使用干擾素，往往病情反復(fù)，甚至惡化。另外，干擾素容易產(chǎn)生副作用，長期使用對患者造成一定傷害。干擾素誘導(dǎo)劑巧妙的解決了這些問題，誘導(dǎo)劑促使機體本身產(chǎn)生干擾素，副作用不明顯[4，5]。

長雙鏈RNA（1ong double str anded RNA，dsRNA）具有較好的干擾素誘導(dǎo)活性。目前研究較多的是聚肌胞（Poly I：C），它是一種人工合成的dsRNA，其具有dsRNA的結(jié)構(gòu)特性，在抗病毒和抗腫瘤的研究中應(yīng)用較多。細胞膜的表面和胞漿內(nèi)含有多種dsRNA的識別受體，dsRNA可以通過不同的細胞信號途徑來激活機體的非特異性免疫應(yīng)答。這其中，比較最重要的是TLR3途徑和RNA解旋酶RIG－I／MDA5途徑[6，7]。本實驗提取新鮮香菇天然dsRNA，以不同濃度作用于小鼠，RT－PCR檢測了肝臟細胞內(nèi)IFN－α的表達情況，結(jié)果顯示實驗組干擾素－αmRNA較對照組表達均顯著升高 （P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），且濃度為5mg·kg－1dsRNA組干擾素－αmRNA的升高最顯著（P＜0.01，P＜0.01）。本實驗說明香菇天然dsRNA可以誘使小鼠肝細胞干擾素－αmRNA表達增加。dsRNA可以誘導(dǎo)干擾素生成這一發(fā)現(xiàn)為中藥抗病毒機制研究提供了一條新思路。中藥抗病毒作用機制往往不為西方醫(yī)藥界所認可，原因是中藥有效單體成分不明確。目前中藥抗病毒研究較多的成分是多糖。本研究提示dsRNA可能是中藥抗病毒的 又 一 有 效 成 分。2006 年，RNAi（RNA interference，RNAi）技術(shù)獲得了諾貝爾獎，小片段dsRNA可以與特定基因互補，特異性地降低或者關(guān)閉這基因表達。然而，同為dsRNA，卻可以一方面關(guān)閉基因的表達（RNAi），另一方面還可以誘導(dǎo)基因的表達（干擾素的生成），這似乎產(chǎn)生了一對“矛盾”，其中的機制未見有人闡述[1]。此外，天然dsRNA的來源、濃度、大小等對于哺乳動物不同組織、細胞的誘導(dǎo)作用的影響有待于進一步研究。天然長dsRNA如何進入細胞、細胞核以及如何誘導(dǎo)基因表達不是很明確，仍需要深入研究。

參考文獻：

[1]張虎，梁啟超，杜新娜，等.天然dsRNA誘導(dǎo)干擾素生成研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2011，34（3）：54

[2]張曉婷，吳祖建，林奇英，等.雙鏈RNA技術(shù)與植物病毒研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2005，20（4）：455－458

[3]李東棟，牛建新，潘立忠.葡萄卷葉病病毒雙鏈RNA（dsRNA）提純分析研究[J].石河子大學學報（自然科學版），2000，4（3）：205－210

[4]李毅，金一，孫倫泉，等.雙鏈RNA的免疫調(diào)節(jié)作用及聚肌胞抗病毒應(yīng)用進展[J].中國生化藥物雜志，2011，32（4）：335－338

[5]陳士俊.干擾素α的抗病毒作用機理[J].山東醫(yī)藥，1999，39（24）：38

[6]Vercammen E，Staal J，Beyaert R.Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll－like receptor 3[J].Clin Micro biol Rev，2008，21（1）：13－25

[7]Sasai M，Shingai M，F(xiàn)unami K，et al.NAK－associated protein 1participates in both the TLR3and the cytoplasmic pathways in type I IFN induction[J].J Immunol，2006，177（12）：8676－8683