舒秀偉，陳生雷，周 麗，劉艷霞，苗玉和，李學(xué)志

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽 111000)

鵝副粘病毒病(Goose Paramyxovirus Disease)是由禽副粘病毒Ⅰ型引起的一種烈性、高度接觸性、致死性傳染病。自1997年由王永坤和辛朝安兩位教授報道該病發(fā)生以來，國內(nèi)許多地區(qū)先后發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生和流行［1］。本病以呼吸困難、腫頭、流淚、喜臥、下痢、脾臟和胰腺腫大、散布大小不一壞死灶、消化道黏膜出血、潰瘍、壞死、結(jié)痂為主要特征［2］，各種年齡的鵝都可發(fā)生本病，雛鵝的發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，是危害我國養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的重要傳染性疾病。本實驗室對2000年3月遼寧彰武某養(yǎng)鵝場采集的病死鵝的肝、脾、肺、腦等病料進(jìn)行了病原分離與鑒定，并對分離毒的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗動物 SPF雞和10日齡SPF雞胚，由遼寧益康生物股份有限公司提供;非免疫鵝(HI≤1∶4)、鵝胚，由遼寧省畜牧科學(xué)研究院豁鵝原種場提供。

1．1．2 NDV 標(biāo)準(zhǔn)抗原和血清、AI(H9、H5)血清由遼寧益康生物股份有限公司研發(fā)中心提供。

1．1．3 康復(fù)鵝血清 由遼寧益康生物股份有限公司研發(fā)中心提供。

1．2 方法

1．2．1 病毒的分離 以無菌方法采取病死鵝的肝臟、脾臟、心血直接涂片，革蘭氏染色后鏡檢。采集病死鵝的肝、脾、肺、腦組織進(jìn)行研磨，加入雙抗，將病料懸液4℃作用4 h后，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚(鴨胚)，0．2 mL/枚，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚(鴨胚)，將24～96 h死亡的雞胚(鴨胚)置4℃過夜后無菌采集尿囊液，并觀察雞胚(鴨胚)病變情況，收集的尿囊液進(jìn)行HA、HI測定。取尿囊液，送解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所進(jìn)行電鏡觀察。

1．2．2 病毒的血清學(xué)鑒定 將分離毒用滅菌生理鹽水稀釋至 105．0ELD50/0．1mL，分別與 10 倍稀釋并經(jīng)56℃30 min滅活的抗鵝副粘病毒高免血清、NDV陽性血清、AI(H9、H5)血清等量混合，在24～30℃中和1 h，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0．2mL，置37℃觀察120 h，對照組接種生理鹽水。記錄雞胚死亡情況，活胚取尿囊液，測定HA效價。

1．2．3 毒力測定

1．2．3．1 ELD50測定 將鵝副粘病毒尿囊液進(jìn)行10倍系列稀釋，選定 3 個稀釋度即 10－7、10－8、10－9，將每個稀釋度分別接種5枚10日齡SPF雞胚和5枚10日齡非免疫鵝胚(CAM接種，0．1 mL/枚)，并設(shè)對照組接種生理鹽水 0．1 mL/枚。37℃孵育120 h，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，用Reed－Muench法計算ELD50［3］。

1．2．3．2 最小致死量的平均致死時間(MDT)測定

用無菌生理鹽水將新收獲的含毒尿囊液做10倍系列稀釋，取 10－7、10－8、10－93 個稀釋度，分別接種10日齡SPF雞胚和10日齡非免疫鵝胚，上午9點每個稀釋度接種5個雞胚或鵝胚，每胚尿囊內(nèi)注射0．1 mL做記號A。下午3點每個稀釋度分別接種5個雞胚或鵝胚，做記號B。接種后，每日上午9點、下午3點，A、B組各照蛋1次，記錄雞胚或鵝胚死亡時間，計算最小致死量的平均死亡時間。并測定每胚血凝活性［4］。

1．2．3．3 腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測定 取1日齡SPF雛雞10只和非免疫雛鵝(HI≤1∶4)10只，各腦內(nèi)注射10－1稀釋的新鮮含毒尿囊液0．05 mL。另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0．05mL。接種后，每日在相應(yīng)接種的時間觀察，記錄雛雞和雛鵝的情況，觀察8 d，計算正常、發(fā)病、死亡雞或鵝的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0，發(fā)病為 1，死亡為 2)累計總分?jǐn)?shù)［4］。

其中，zi和zi′分別為像素i和i′的光譜測度；‖zi-zi′‖用以計算zi與zi′間的歐氏距離；σi為像素i的尺度參數(shù).令zi={‖zi-zi″‖,i″Ni}且‖zi-zi″‖按增序排列，取σi=zi(#Ni / M)，為取整操作符，#為計算集合所含元素總數(shù)操作符，M[2,6]為指定整數(shù)[22]，控制σi的取值，可根據(jù)待分割影像選取不同的M值.

1．2．3．4 靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測定 取6周齡SPF雞10只和非免疫鵝(HI≤1∶4)各10只，靜脈接種10－1稀釋的含毒尿囊液0．1 mL，另各取2只接種生理鹽水作對照。每日在接種的相應(yīng)時間觀察、記錄接種雞或鵝情況，觀察10 d后，累計正常、發(fā)病、麻痹和死亡動物數(shù)，根據(jù)不同權(quán)值(正常為0，發(fā)病為 1，麻痹為 2、死亡為3)累計總分?jǐn)?shù)［4］。

1．2．4 動物回歸試驗 取10日齡鵝、30日齡SPF雞各10只，取收集的雞胚尿囊液，10倍稀釋后每只肌肉注射0．1 mL。并各設(shè)5只空白對照。嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，觀察接種后的發(fā)病和死亡情況，并從病死鵝和雞中分離病毒。

1．2．5 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)國外發(fā)表的NDV的F基因序列設(shè)計一對引物，進(jìn)行RT－PCR鑒定，預(yù)期目的片段大小1660 bp。引物序列如下:

上游引物P1:5’－AATATGGGCTCCAAACC－3’

下游引物P2:5’－ATGCTCTTGTGGTGGCT－3’

1．2．6 免疫原性測定 將鵝副粘病毒分離毒做10－4稀釋，然后接種于10日齡SPF雞胚，收獲雞胚尿囊液(HA≥27)，經(jīng)0．1%甲醛滅活后，與白油以1∶1．5的比例混合，制成油乳苗。用10日齡SPF雞和5日齡非免疫鵝(HI≤1∶4)各20只(微量法，按《中國獸藥典》進(jìn)行)，每只胸部肌肉注射滅活疫苗0．2 mL，21 d后連同對照雞和鵝各10只，胸部肌肉注射105ELD50強(qiáng)毒，觀察14 d。

2 結(jié)果

2．1 病毒的初步分離 以無菌方法采取病死鵝的肝臟、脾臟、心血直接涂片，革蘭氏染色后鏡檢，未見致病菌。初次分離病毒時，病毒可直接適應(yīng)鴨胚，但不能直接適應(yīng)于雞胚，需經(jīng)一代或一代以上的鴨胚傳代后才適應(yīng)雞胚。取適應(yīng)雞胚的病毒接種于10日齡的雞胚尿囊腔，0．1 mL/枚，雞胚于48～60 h全部死亡，雞胚胚體出現(xiàn)的病變與鴨胚基本一致。死亡雞胚病變均為全身表面點狀彌漫性出血，胚體明顯矮小，體表和內(nèi)臟嚴(yán)重出血(圖1)。取胚液進(jìn)行微量法HA試驗，結(jié)果表明收集的尿囊液能凝集雞紅細(xì)胞，凝集價(HA)在27～29之間。而且該凝集作用能被NDV陽性血清和康復(fù)鵝血清所抑制，抑制價(HI)為29和27。而禽流感陽性血清(H5、H9)則不能抑制分離毒凝集紅細(xì)胞的作用。

圖1 接種后48 h死亡雞胚病變

2．3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 電鏡下呈現(xiàn)典型的副粘病毒形態(tài)，大量大小不一的病毒粒子多數(shù)呈圓形，表面有密集的纖突結(jié)構(gòu)，病毒粒子大小在50～200 nm之間。電鏡照片見圖2。

圖2 鵝副粘病毒YF株電鏡照片

2．4 血清學(xué)鑒定結(jié)果 NDV陽性血清和康復(fù)鵝血清能特異性中和分離毒，接種雞胚未見死亡;而禽流感H9、H5標(biāo)準(zhǔn)血清中和組接種雞胚則全部死亡，其尿囊液具有血凝性;生理鹽水對照組則沒有血凝性。

2．5 毒力測定結(jié)果 此毒株對雞胚半數(shù)致死量可達(dá) 10－8．3/0．1mL，對鵝胚的半數(shù)致死量可達(dá)到10－8．7/0．1mL;對雞胚最小致死量為 10－7稀釋度，平均死亡時間為51．6 h，鵝胚最小致死量為10－7稀釋度，平均死亡時間為68．6 h;對雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為 1．75，鵝的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為1．70，對雞的靜脈致病指數(shù)(IVPI)為 1．68，鵝的靜脈致病指數(shù)(IVPI)為1．72。

2．6 動物回歸試驗 將分離毒的雞胚尿囊液10倍稀釋后接種10日齡鵝、30日齡SPF雞，接種后第2天和第3天全部發(fā)病，發(fā)病癥狀與病變與自然病例特征相似，至第14天觀察結(jié)束時，均全部死亡。從病死的鵝和雞中都分離到具有血凝性的病毒。

2．7 RT－PCR結(jié)果 以分離毒雞胚尿囊液提取的總RNA為模版，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到一條1．7 kb左右的特異性條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符，見圖3。說明分離毒是與NDV相關(guān)的副粘病毒。

圖3 分離毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．8 免疫原性測定 免疫雞和鵝均100%保護(hù)，對照雞100%死亡;對照鵝100%發(fā)病，80%死亡。結(jié)果表明該分離毒具有良好的免疫原性，可激發(fā)SPF雞、非免疫鵝產(chǎn)生保護(hù)性抗體。

3 小結(jié)與討論

3．1 本試驗應(yīng)用SPF雞胚從發(fā)病鵝群中分離到一株病毒，經(jīng)HA和HI試驗、血清中和試驗、電鏡觀察、動物回歸試驗、RT－PCR鑒定等確認(rèn)為鵝源副粘病毒，并命名為YF株。該病毒具有血凝活性，能使SPF雞胚、非免疫鴨胚、鵝胚100%死亡。一般認(rèn)為，鵝可以感染副粘病毒，但感染后一般只帶毒和排毒，不使鵝致病。但國內(nèi)學(xué)者先后分離到了能使鵝發(fā)病和致死的同類病毒［5－8］，本實驗分離的病毒，通過人工感染SPF雞和鵝，證實該分離株對雞和鵝具有高度的致病性。

3．2 對分離株分別應(yīng)用實驗動物，SPF雞和非免疫鵝(HI≤1∶4)進(jìn)行了 MDT、ICPI和 IVPI等項生物學(xué)致病性測定，應(yīng)用SPF雞測定的結(jié)果，MDT為51．6h、ICPI為 1．75、IVPI為 1．68，應(yīng)用非免疫鵝測定的結(jié)果，MDT 為 68．6h、ICPI為 1．70、IVPI為1．72，結(jié)果表明分離株對鵝的致病性指標(biāo)與應(yīng)用SPF雞測定的指標(biāo)具有一定的相關(guān)性。參照國際上規(guī)定的NDV毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，該分離株為強(qiáng)毒，進(jìn)一步證實所分離到的野毒屬禽副粘病毒的成員，即鵝副粘病毒I型。

3．3 免疫原性試驗表明，該病毒在實驗動物雞和鵝上都具有良好的免疫原性，并且具有很高的保護(hù)率。

［1］ 左玉柱．鵝源副粘病毒病［J］．山東家禽，2004，(4):27 －28．

［2］ 錢 晨，張建軍．鵝副粘病毒感染的診斷［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(36):11837．

［3］ 殷 震，劉景華．動物病毒學(xué)［M］．第2版．北京:科學(xué)出版社，1997．

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001:316－318．

［5］ 辛朝安，任 濤，羅開健，等．疑似鵝副粘病毒感染診斷初報［J］．養(yǎng)禽與禽病防治，1997，1:5．

［6］ 周繼宏，田慧芳，王永坤，等．鵝副粘病毒感染雞試驗［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(1):3 －4．

［7］ 周繼宏，田慧芳，王永坤，等．鵝副粘病毒的人工感染試驗［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21(1):51 －52．

［8］ 黃淑堅，白挨泉．鵝副粘病毒病病原的分離及初步鑒定［J］．中國獸醫(yī)雜志，2000，26(3):20 －21．