毛婭卿，王 嘉，王 哲，吳 濤

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，疫苗的研制和開(kāi)發(fā)取得了快速的發(fā)展。以重組病毒作為基因工程活載體疫苗，可同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，避免了滅活疫苗的缺陷，又無(wú)常規(guī)疫苗毒力返強(qiáng)之虞，尤為重要的是可以同時(shí)構(gòu)成多價(jià)乃至多聯(lián)疫苗，使之成為近幾年來(lái)新型疫苗研制最為活躍也是最有希望的發(fā)展方向。然而，大多數(shù)野生型病毒對(duì)機(jī)體都具有致病性。因此需要對(duì)其進(jìn)行改造后才能用于機(jī)體。原則上，各種類(lèi)型的病毒都能被改造成病毒載體。但是由于病毒的多樣性及與機(jī)體復(fù)雜的依存關(guān)系，人們至今對(duì)許多病毒的生活周期、分子生物學(xué)、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認(rèn)識(shí)還很不全面，從而限制了許多病毒發(fā)展成為具有實(shí)用性的載體。近20年來(lái)，只有少數(shù)幾種DNA病毒及RNA病毒被成功地改造成為基因轉(zhuǎn)移載體［1］并開(kāi)展了不同程度的應(yīng)用。

1 DNA病毒載體

1．1 痘病毒載體 痘病毒科是一大群、專(zhuān)性的病毒，感染的痘病毒病毒粒子形狀呈磚形，直徑300～400 nm，基因組由130～300 kb的單線(xiàn)雙鏈DNA分子組成。

痘病毒在病毒學(xué)、免疫學(xué)和疫苗學(xué)等方面發(fā)揮著十分重要的作用。1789年，Dr．Edward Jenner證明牛痘病毒可以用于人類(lèi)的免疫接種，預(yù)防天花的感染，這一發(fā)現(xiàn)奠定了免疫學(xué)的基礎(chǔ)，同時(shí)也為實(shí)施全球性的免疫接種，并最終為從地球上消滅天花奠定了基礎(chǔ)。后來(lái)，牛痘病毒被痘苗病毒(vaccinia virus，VV)所取代。1980年，世界衛(wèi)生組織宣布人類(lèi)消滅了天花，建議不再進(jìn)行天花的疫苗接種。在過(guò)去的20多年中科學(xué)工作者做出了不懈的努力以改進(jìn)重組病毒的安全性，這種改進(jìn)措施包括兩個(gè)方面，一方面是通過(guò)基因工程手段對(duì)VV進(jìn)行致弱，另一方面是用禽痘病毒載體作為替代，構(gòu)建安全高效表達(dá)外源基因的非復(fù)制型載體。目前，在基因的表達(dá)、疾病治療和疫苗開(kāi)發(fā)方面，禽痘病毒已經(jīng)成了使用最為廣泛的表達(dá)載體，在禽類(lèi)疾病新型疫苗的研制方面得到了很好的應(yīng)用。這些年，痘病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用見(jiàn)表1。

表1 痘病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用［2-5］

1．2 皰疹病毒載體 皰疹病毒科分為4個(gè)亞科:皰疹病毒甲亞科、皰疹病毒乙亞科、皰疹病毒丙亞科及未定名亞科。同痘病毒一樣，皰疹病毒的基因組較大，約150 kb，可容納多個(gè)外源基因的插入。

大多數(shù)皰疹病毒(偽狂犬病毒除外)的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會(huì)產(chǎn)生流行病學(xué)方面的不良后果。許多皰疹病毒經(jīng)黏膜途徑感染，構(gòu)建的活載體疫苗可經(jīng)黏膜途徑提呈抗原，誘導(dǎo)特異性黏膜免疫。皰疹病毒活載體主要包括單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、火雞皰疹病毒、I型牛皰疹病毒、河馬皰疹病毒I型。其中，偽狂犬病毒活載體疫苗是病毒基因工程研究中比較活躍的領(lǐng)域，I型牛皰疹病毒活載體疫苗也有諸多相關(guān)報(bào)道。這些年，皰疹病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用見(jiàn)表2。

表2 皰疹病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用［6-7］

1．3 腺病毒載體 腺病毒屬于腺病毒科，根據(jù)宿主范圍不同，將腺病毒分為哺乳動(dòng)物腺病毒和禽類(lèi)腺病毒兩個(gè)屬。

腺病毒載體能高效表達(dá)外源基因，并能對(duì)外源蛋白進(jìn)行剪切、糖基化、磷酸化等反應(yīng)后加工，表達(dá)的蛋白具有天然蛋白的特性，可用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域，已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。重組腺病毒可以通過(guò)注射、口服、氣管接種等途徑進(jìn)行免疫，接種動(dòng)物不僅產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，而且還可以產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，對(duì)預(yù)防呼吸道、消化道的感染具有極其重要的意義。這些年，腺病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用見(jiàn)表3。

1．4 桿狀病毒載體 昆蟲(chóng)桿狀病毒研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒和家蠶核型多角體病毒，用來(lái)表達(dá)外源蛋白也多用這兩種桿狀病毒載體。

表3 腺病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用［8-9］

桿狀病毒表達(dá)載體是一種輔助性依賴(lài)的真核DNA表達(dá)載體，已有近千種外源基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)得到表達(dá)。Wang SP等構(gòu)建了豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5和ORF6雙基因共表達(dá)的重組假型桿狀病毒疫苗，小鼠免疫試驗(yàn)證實(shí)，重組病毒所誘導(dǎo)的IFN－γ水平和中和抗體水平均明顯高于常規(guī)DNA疫苗免疫組［10］。余光清等也用該系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)日本血吸蟲(chóng)的谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GST)的重組DNA疫苗，也獲得了較好的免疫保護(hù)力。除此之外，重組桿狀病毒表達(dá)偽狂犬病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、兔病毒性出血癥病毒VP60蛋白等的DNA疫苗也獲得了較好的免疫效果［11－12］，表明重組桿狀病毒 DNA疫苗是一種具有良好發(fā)展前景的疫苗載體。

2 RNA病毒載體

2．1 副粘病毒載體 副粘病毒成多形性，直徑150 nm或更大，有包膜。病毒粒內(nèi)含呈螺旋對(duì)稱(chēng)的核殼，核酸是一條連續(xù)的單鏈RNA長(zhǎng)分子。

隨著反向遺傳學(xué)操作技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的RNA病毒成為病毒載體的研究對(duì)象，副粘病毒科中的新城疫病毒(NDV)的研究相對(duì)比較成熟，其基因組結(jié)構(gòu)、分子特性及其相關(guān)性質(zhì)了解的比較透徹，應(yīng)用研究的也比較多［13］。Nakaya T［14］等在NDV Hitchner B1株P(guān)和M基因之間分別插入了CAT報(bào)告基因和流感病毒的HA基因，小鼠體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)艿挚怪滤绖┝康牧鞲胁《镜墓?，說(shuō)明NDV作為疫苗載體是非常有效的。Ge JY等在NDV P和M基因之間分別插入高致病性禽流感(HPAIV)的野毒株和變異株的HA基因，在活體試驗(yàn)中均能抵抗致死劑量的NDV和AIV的攻擊，說(shuō)明用NDV載體做二聯(lián)苗是非常有前景的。

NDV載體作為一種重要的分子生物學(xué)工具，不僅在疫苗研究方面具有不可替代的地位，而且作為基因治療載體的研究也日益進(jìn)展。雖然NDV抗腫瘤的確切的機(jī)制尚未完全闡明，但隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和分子病毒學(xué)的發(fā)展，NDV作為一種有效的病毒載體具有廣闊的應(yīng)用前景是毋庸置疑的。

2．2 彈狀病毒載體 彈狀病毒粒是形態(tài)似棒狀或子彈狀的一科。病毒粒的大小為(130～380)nm×70 nm，核心為螺旋對(duì)稱(chēng)的核殼，內(nèi)含連續(xù)線(xiàn)型單負(fù)鏈 RNA，分子量為(3．5 ～4．6)×106。

其中的水皰性口炎病毒(vesivularstomatitis virus，VSV)載體已被開(kāi)發(fā)成為一種有效的治療制劑［15］。VSV病毒載體是一種高效的溶瘤病毒載體，具有非常廣的溶瘤范圍。VSV載體也被開(kāi)發(fā)成為一種有效的疫苗載體，VSV作為疫苗載體應(yīng)用到獲得性免疫綜合癥病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制過(guò)程中。

2．3 甲病毒載體 甲病毒屬于披膜病毒科，包括辛德畢斯病毒、西門(mén)利克森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等30個(gè)成員。

甲病毒是一類(lèi)能在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)大量復(fù)制的RNA病毒。用外源基因替換結(jié)構(gòu)蛋白基因的甲病毒載體，仍具有甲病毒的宿主感染譜廣泛、能夠自我復(fù)制、誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生凋亡等眾多生物學(xué)特性，同時(shí)能夠大量表達(dá)外源基因，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫反應(yīng)，并不易與宿主基因組整合［16］。利用甲病毒的生物學(xué)特性，改造出相應(yīng)的甲病毒載體，已被廣泛地應(yīng)用于基因治療和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。1996年，Invitrogen公司率先推出了商品化的甲病毒載體［17］。

2．4 冠狀病毒載體 冠狀病毒粒子呈不規(guī)則形狀，直徑約60～220 nm。其核酸為非節(jié)段單鏈(+)RNA，長(zhǎng)27～31 kd，是 RNA病毒中最長(zhǎng)的RNA核酸鏈。

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了兩類(lèi)基于冠狀病毒的表達(dá)載體，即輔助病毒依賴(lài)的表達(dá)載體系統(tǒng)和單基因組表達(dá)載體系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)冠狀病毒感染性cDNA進(jìn)行改造可以獲得外源基因的高效、穩(wěn)定表達(dá)［18］。此外，冠狀病毒載體以下幾個(gè)特征使其成為非常具有吸引力的載體:①通過(guò)刪除非結(jié)構(gòu)基因、組織特異性基因可以將冠狀病毒轉(zhuǎn)化為無(wú)毒力的病毒;②通過(guò)對(duì)S蛋白的改造可以改變冠狀病毒的組織和物種嗜性，從而將外源基因定向表達(dá)到不同的組織器官或物種。因此，冠狀病毒對(duì)于疫苗開(kāi)發(fā)以及基因治療是前景非常好的載體。

2．5 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 反轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒特征為其基因組是雙股(+)RNA，具有二十面體對(duì)稱(chēng)核心，內(nèi)含核醣蛋白，外有包膜。

反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種新的重組蛋白高效表達(dá)系統(tǒng)［19］，由反轉(zhuǎn)錄病毒載體、包膜蛋白載體和包裝細(xì)胞系組成。反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作、轉(zhuǎn)染效率高、容量較大、宿主范圍廣、易于分離等優(yōu)點(diǎn)，在外源基因表達(dá)、基因治療、轉(zhuǎn)基因研究、生物制藥等方面應(yīng)用廣泛。

2．6 黃病毒載體 黃病毒屬是一大群具有包膜的單正鏈RNA病毒。在我國(guó)，主要的黃病毒成員有乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒和登革病毒。

目前所有黃病毒載體疫苗的研發(fā)均處于臨床前階段，而與其異常相近的黃病毒嵌合疫苗卻發(fā)展得更為迅速。黃病毒嵌合疫苗［20］，是以一種黃病毒的結(jié)構(gòu)基因替代另一種黃病毒的相同基因而獲得的疫苗。由于外源基因和載體病毒之間的種間差異小，替代的基因具有類(lèi)似的功能，所以嵌合疫苗的技術(shù)難度相對(duì)較低。與載體疫苗相比，嵌合疫苗技術(shù)只能用于預(yù)防性疫苗的研制，并且應(yīng)用范圍僅限于黃病毒預(yù)防疫苗。但這種技術(shù)與黃病毒載體技術(shù)極其類(lèi)似，其應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)可作為黃病毒載體技術(shù)的基礎(chǔ)，因此，這種技術(shù)的迅猛發(fā)展也預(yù)示著黃病毒載體技術(shù)具有美好的發(fā)展前景。

3 病毒載體之比較

每種病毒載體都存在各自的優(yōu)劣勢(shì)，它們之間的比較見(jiàn)表4。

表4 各種病毒載體優(yōu)劣勢(shì)比較

續(xù)表

4 結(jié)語(yǔ)

目前，盡管病毒載體系統(tǒng)在研究和實(shí)驗(yàn)上取得了很大的進(jìn)展，數(shù)個(gè)病毒載體已實(shí)現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，且多個(gè)病毒載體能同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，但病毒載體的安全性和靶向性問(wèn)題還有待進(jìn)一步的研究解決。研究表明通過(guò)使用組織特異性啟動(dòng)子或多聚物和脂質(zhì)體的修飾，可提高基因轉(zhuǎn)移的靶向性，且多聚物和脂質(zhì)體的修飾還可減輕免疫反應(yīng)，有利于載體的重復(fù)應(yīng)用。針對(duì)有些病毒載體插入外源基因的能力較低、插入宿主基因組、多次免疫后機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)載體部分的抗體、轉(zhuǎn)基因生物釋放等的劣勢(shì)，可調(diào)控表達(dá)外源基因的病毒載體、靶向性載體、無(wú)病毒基因的病毒載體甚至是自我滅活或自我破壞的病毒載體應(yīng)該是今后努力的目標(biāo)。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，病毒載體系統(tǒng)會(huì)得到進(jìn)一步完善提高，從而早日實(shí)現(xiàn)病毒活載體疫苗的產(chǎn)業(yè)化。

［1］ Alejandro Brun，Emmanuel Albina，Tom Barret，et al．Antigen delivety systems for veterinary vaccine development Viral－vector based delivery systems［J］．Vaccine，2008，26:6508 －6528．

［2］ 金寧一，殷 震．痘苗病毒載體研究進(jìn)展［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23(4):301 －304．

［3］ 孫 鵬，王云峰，胡桂學(xué)．禽痘病毒載體及其應(yīng)用［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37(9):82 －85．

［4］ Merchlinsky M，Moss B．Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation:Recombinationindependent selectable cloning vectors．Virology，1992，190(9):522－556．

［5］ Boyle D B，Anderson M A，Amos R，et al．Construction of recombinant fowlpox viruses carrying multiple vaccine antigens and immunomodulatorymolecules．Biotechniques，2004，37(7):8 －11．

［6］ 劉培欣，曹殿軍．重組火雞皰疹病毒載體疫苗研究進(jìn)展［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息，2003，11:118 －121．

［7］ Otsuka H，Xuan X，Shibata I，et al．Protective immunity of bovine herpesvirus－1(BHV－1)recombinants which express pseudorabies virus(PRV)glycoproteins gB，gC，gD，gE［J］．J Vet Med Sci，1996，58:8219 －8224．

［8］ 王玉泉，馬立賓，于秋蓮．動(dòng)物腺病毒載體的研究進(jìn)展［J］．內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，24(2):180－183．

［9］ Reddy P S，Idamakanti N，Chen Y，et al．Replication － defective bovine adenovirus type 3 as an expression vectorr［J］．Journal of Virology，1999，73(11):9137 －9144．

［10］王立良，宋國(guó)興，司馬懿．桿狀病毒載體研究進(jìn)展［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，1998，20(5):222 －226．

［11］曹 虎．桿狀病毒載體研究進(jìn)展［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，1998，20(5):222 －226．

［12］ Huser A，Rudolph M，Hofmann C．Incorporation of decay－accelerating factor into the baculovirusenvelope generates complementresistant gene transfer vectors［J］．Nat Biotechnol 2001，19:451－455．

［13］孫玉章，母連志，丁 壯．新城疫病毒載體研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(11):91 －94

［14］ Peeters B P，de Leeuw O S，Verstegen I，et al．Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals［J］．Vaccine，2001，19(2):1616 －1627．

［15］ Ezelle H J，Markovic D，Barber G N．Generation of hepatitis C virus－like particles by use of a recombinant vesicular stomatitis virus vector［J］．JVirol，2002，76(12):12325 －12334．

［16］周 鵬，聶 奎．甲病毒載體疫苗研究進(jìn)展［J］．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2006，7:430 －433．

［17］ Lundstrom K．Alphavirus vectors:applications for DNA vaccine production and gene expression［J］．Intervirology，2000，43:247－257．

［18］ Enjuanes L，Sola I，Alonso S，et al．Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression［J］．Curr Top Microbiol Immunol，2005，287:161 －197．

［19］朱春雨，侯 銳，高福蓮．反轉(zhuǎn)錄病毒載體的研究進(jìn)展［J］．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，1:85 －87．

［20］ 郭銀漢，王曉鵬．黃病毒載體技術(shù)［J］．病毒學(xué)報(bào)，2005，21(6):485－487．