曾宇君，劉 娟，，黃 勇

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460;2.重慶市藥效評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

維生素D是機(jī)體必需的一種維生素，屬于類固醇類激素，在體內(nèi)具有多方面活性，是促進(jìn)機(jī)體鈣磷吸收的主要元素。維生素D2與維生素D3對(duì)哺乳動(dòng)物的活性基本相同，且對(duì)包括家禽在內(nèi)的鳥類，維生素D3的活性遠(yuǎn)高于維生素D2，約20～40倍［1］。因此，獸醫(yī)臨床多采用維生素D3進(jìn)行相關(guān)疾病的治療。但是維生素D3對(duì)光照和高溫不穩(wěn)定，常規(guī)制劑易降解失效，難以保證其質(zhì)量穩(wěn)定性。固體分散技術(shù)可將易揮發(fā)、易分解的不穩(wěn)定藥物制成固體分散體系，增加藥物穩(wěn)定性，減少用藥劑量，提高藥物生物利用度，并可根據(jù)需要制成片劑、注射劑、散劑以及栓劑等［2］。需要注意的是，固體分散體長(zhǎng)時(shí)間貯存會(huì)出現(xiàn)硬度增加、析出結(jié)晶、藥物溶出度降低的情況，即老化現(xiàn)象［3］。目前在維生素藥物中對(duì)維生素C和維生素E采用固體分散技術(shù)進(jìn)行新制劑制備的報(bào)道較多，制備維生素D3新制劑的報(bào)道較少，本試驗(yàn)對(duì)維生素D3固體分散體片進(jìn)行了工藝與穩(wěn)定性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品 維生素D3固體分散體片(重慶天龍牧業(yè)科技有限公司制備);維生素D3對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)1001－200505);維生素 D3(鄭州匯鑫科技股份有限公司，批號(hào)20081108);PEG－6000(成都科立隆化工貿(mào)易有限公司，批號(hào)20081009);乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20080309);甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080702);氯仿(天津市博迪化工有限公司，批號(hào)20080220);醋酐(重慶川東化工有限公司，批號(hào)20080415);濃硫酸(重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠，批號(hào)20070831)。

1.1.2 儀器 電子天平(YP1200型，上海精科);高效液相色譜儀(型號(hào)waters 2487，天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司);電子恒溫水浴鍋(DXKW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司);超聲波振蕩器(KQ3200E，寧波科生超聲設(shè)備公司)。

1.2 方法

1.2.1 維生素D3固體分散體的制備條件 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以分散比例(因素A)、溫度(因素B)、光照(因素C)為考察因素，維生素D3含量為檢測(cè)指標(biāo)，采用L4(23)正交表［4］，篩選優(yōu)良的制備工藝，正交試驗(yàn)方案見表1。

按照上述方案，采用熔融法制備維生素D3固體分散體，將維生素D3均勻分散至載體熔融液中，冷凍干燥，研末，過(guò)80目篩，置冰箱(4℃)內(nèi)備用［5］。

表1 維生素D3固體分散體制備方案正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.2 維生素D3固體分散體片與普通片的制備工藝 參照文獻(xiàn)［6］，將維生素D3固體分散體以適當(dāng)比例和空白淀粉粒子、硬脂酸鎂、滑石粉混合均勻，制成維生素D3固體分散體片，按0.5 g/片進(jìn)行壓片，維生素D3的含量為1250單位/片。取處方量維生素D3溶解于乙醇中，均勻噴灑在空白淀粉粒子上，以適當(dāng)比例與硬脂酸鎂、滑石粉混合均勻，制成維生素D3普通片，按0.5 g/片進(jìn)行壓片，維生素D3的含量為1250單位/片。

1.2.3 定性鑒別 取維生素D3原料約0.5 mg，加入氯仿5 mL溶解，再依次加入醋酐0.3 mL和濃硫酸0.1 mL，振搖，觀察顏色變化［7］。維生素 D3固體分散體片和普通片，可先分別研磨過(guò)80目篩后，取適量粉末再進(jìn)行上述操作。

1.2.4 含量測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)［8］，測(cè)定方法如下。

1.2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取維生素D3對(duì)照品0.05 g置50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精確量取上述溶液1 mL稀釋到10 mL，作為對(duì)照品溶液，置冰箱(4℃)內(nèi)備用，對(duì)照品溶液含維生素D3100 mg/L。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱:Waters 38145－21柱(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為甲醇 ∶乙腈=90∶10;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣體積5 μL;檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器。

1.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用甲醇分別稀釋對(duì)照品溶液至 50、20、10、2、0.5 mg/L，在上述色譜條件下分別吸取5 μL進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性擬合，同時(shí)用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y=223427X+35460，R2=0.9999。結(jié)果表明，維生素D3進(jìn)樣量在2.5～250 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.4.4 供試品溶液的制備 分別取維生素D3固體分散體片和普通片各若干片，放器皿中研細(xì)，攪拌均勻。精密稱取樣品5 g于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至8 mL，搖勻，超聲溶解20 min，加流動(dòng)相定容至刻度，再搖勻，將溶液轉(zhuǎn)移到離心管，放置到離心機(jī)中4000 r/min離心10 min。將離心后的溶液上層清液，取0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液為供試品溶液。精密量取5 μL供試品溶液進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)峰面積用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算維生素D3的相對(duì)百分含量。

1.2.5 維生素D3固體分散體片穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn) 在溫度為25℃，將維生素D3固體分散體片用普通白色塑料袋密封包裝，置于照度4500 Lx下放置10 d，進(jìn)行加速試驗(yàn)，在第0、5、10 天各取樣 1 次，設(shè)普通片為對(duì)照組，按1.2.4項(xiàng)下方法測(cè)定維生素D3含量。

1.2.5.2 加速試驗(yàn) 在溫度(40±2)℃、相對(duì)濕度75% ±5%條件下，將維生素D3固體分散體片用普通白色塑料袋密封包裝放置6個(gè)月，進(jìn)行加速試驗(yàn)，在第0、1、2、3、4、5、6 個(gè)月各取樣1 次，設(shè)普通片為對(duì)照組，按1.2.4項(xiàng)下方法測(cè)定維生素D3含量。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)工藝研究結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果可見，以A2B1C2組合為最佳工藝，即維生素D3和分散載體按照1∶20的比例，經(jīng)60℃水浴，在避光的情況下進(jìn)行固體分散包被，其含量最高，工藝為最佳，詳見表2。

表2 維生素D3固體分散體制備方案正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 定性鑒別結(jié)果 鑒別結(jié)果見表3，維生素D3固體分散體片鑒別顯色均符合要求，且第1、4步顯色明顯，而維生素D3普通片只有第4步顯色明顯，第1步顯色不明顯，中間兩步無(wú)顏色變化。

表3 維生素D3原料、固體分散體片和普通片的理化鑒別結(jié)果

2.3 含量測(cè)定結(jié)果 維生素D3高效液相色譜圖見圖2。根據(jù)維生素D3固體分散體片與普通片的出峰面積，將其分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出維生素D3的含量(圖3)。維生素D3固體分散體片的平均相對(duì)百分含量為97.94%，普通片為95.6%。

圖2 維生素D3高效液相色譜圖

2.4 維生素D3固體分散體片穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.4.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 在上述光照條件下，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，維生素D3固體分散體中維生素D3含量微有下降，但保持在高含量水平;普通片含量下降明顯，第5天實(shí)驗(yàn)室判斷已為不合格，結(jié)果見圖4。

2.4.2 加速試驗(yàn)結(jié)果 維生素D3固體分散體片中維生素D3含量隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)雖有微量降解，但無(wú)明顯變化;而普通片則發(fā)生了較大變化，第2個(gè)月實(shí)驗(yàn)室判斷已為不合格，結(jié)果見圖5。

3 討論

3.1 維生素D3性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、氧、熱等易發(fā)生降解而失效，導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度降低。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果可看出，載體、溫度、光照是影響維生素D3固體分散體穩(wěn)定性的三大因素，增加載體比例、降低包被溫度、避免光照可有效阻隔維生素D3和空氣、光、熱的接觸，大大減緩藥物在生產(chǎn)、貯存過(guò)程中被水解和氧化。正交試驗(yàn)結(jié)果中A2B1C2組合鑒別顯色結(jié)果最明顯且所測(cè)相對(duì)百分含量最高，所以維生素D3固體分散體的最佳工藝為:維生素D3和載體PEG－6000按照1∶20的比例，經(jīng)60℃水浴，在避光的情況下進(jìn)行固體分散包被。將易氧化分解的維生素D3制備成固體分散體，可以大大提高維生素D3的穩(wěn)定性和生物利用度，減少毒副反應(yīng)，防治動(dòng)物維生素D缺乏癥，具有安全、有效、應(yīng)用方便的優(yōu)勢(shì)［9］。

3.2 穩(wěn)定性研究的目的是考察藥物及其制劑在溫度、濕度和光線的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存和運(yùn)輸條件提供科學(xué)依據(jù)，是新藥研究必不可少的內(nèi)容［10］。通過(guò)對(duì)維生素D3固體分散體片穩(wěn)定性的考察，發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)條件下，維生素D3固體分散體片較普通片抗光、氧、熱的能力更強(qiáng)，可有效保護(hù)藥物的成分，提高生物利用率。但試驗(yàn)結(jié)果也顯示，固體分散體片在光照、高溫和潮濕環(huán)境下，也有部分降解，故維生素D3固體分散體片應(yīng)干燥、常溫、避光貯存。

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