賈慧勤，丁煥中* ，劉曉云，李小紅，張炳旭，魯曉雄

(1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642;2．廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510641)

呋喃唑酮是人工合成具有5－硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物(結(jié)構(gòu)見圖1)，代謝迅速，主要用于腸炎和菌痢的治療［1］。此藥抗菌譜廣，較少產(chǎn)生耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。呋喃唑酮原藥及其主要代謝物3－氨基－2－噁唑烷酮具有致畸致突變作用［2－3］。因此含有呋喃唑酮?dú)埩舻漠a(chǎn)品被人食用后，會對人體造成嚴(yán)重危害。目前歐盟、美國、韓國、日本、韓國、中國等將呋喃唑酮列為食品動物禁用藥物。

圖1 呋喃唑酮及其代謝物

水產(chǎn)品及畜禽產(chǎn)品中呋喃唑酮及其代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［5］、高效液相色譜 －質(zhì)譜法(HPLC－MS)［6］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法(LC － MS/MS)［7］、酶 聯(lián)免疫分析法(ELISA)［8］。HPLC －MS及 LC －MS/MS法的優(yōu)點(diǎn)是能夠在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，而且靈敏度高，但受高昂的儀器成本、復(fù)雜的樣品處理過程及耗時長等限制，難以在基層檢測單位普及。ELISA法操作簡便快速，可大大提高檢測效率，符合現(xiàn)場快速篩選要求。但是目前市場上所有ELISA試劑盒和膠體金試紙條檢測方法都是先將生物樣品用對醛基苯甲酸衍生化，抽提出衍生物后再檢測，這種檢測方法前處理步驟繁瑣且耗時較長。解決這一問題首要是制備出抗AOZ特異性抗體，這樣樣品就不必衍生化處理，檢測時間縮短。本研究通過改造呋喃唑酮代謝物結(jié)構(gòu)得到半抗原，采用N－羥基琥珀酰亞胺活化酯法制備了人工抗原，抗AOZ特異性抗體的制備為免疫檢測方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料及主要儀器 AOZ，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室合成;對醛基苯甲酸、鈀碳、1－乙基3－(3－二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N－羥基琥珀酸亞胺(NHS)，阿拉丁試劑公司;牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)，上海金穗生物科技有限公司;羊抗兔IgG－HRP、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigam公司;新西蘭大白兔，廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器廠;液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫6430;紫外/可見分光光度計(jì)，UV－1800，島津公司;酶聯(lián)免疫檢測儀、離心機(jī)，Thermo scientific;磁力攪拌器，鞏義市予華儀器廠。

1．2 半抗原制備與鑒定 首先以AOZ與對醛基苯甲酸反應(yīng)合成CPAOZ。取AOZ 204 mg(2 mmol)溶于5mL甲苯，磁力攪拌下加入對醛基苯甲酸300 mg(2 mmol)，100℃冷凝回流120 min。停止反應(yīng)，乙酸乙酯洗滌三次后過濾蒸干得白色固體(合成路線見圖2)。用HPLC－MS/MS鑒定目標(biāo)產(chǎn)物。

圖2 CPAOZ的合成路線

取234 mg(1 mmol)CPAOZ溶于4 mL N，N－二甲基甲酰胺(DMF)中，加入適量的鈀碳，通入氫氣于25℃下攪拌反應(yīng)，通過TLC板監(jiān)控反應(yīng)程度，待反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)完全后用適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。反應(yīng)路線見圖3。用HPLC－MS/MS鑒定目標(biāo)產(chǎn)物。

圖3 半抗原合成路線

1．3 完全抗原的制備 采用N－羥基琥珀酰亞胺活化酯法以BSA為載體蛋白合成人工免疫抗原。稱取15．5 mg半抗原、18 mg EDC、11 mg NHS 溶于DMF中，反應(yīng)過夜，得A液;稱取50 mg BSA，溶于PBS，得B液。將A液逐滴加入B液，反應(yīng)4 h。透析3 d，1 d換液2次，離心，分裝，F(xiàn)olin－酚法測定抗原濃度。紫外可見分光光度法鑒定完全抗原。同時，以相同偶聯(lián)方法以 OVA作為載體合成包被原。

1．4 動物免疫 選用2只體重2 kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，生理鹽水稀釋免疫原，經(jīng)弗氏完全佐劑乳化后皮下注射，免疫劑量為200μg/只。每隔3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時，免疫原用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。第3次免疫后的第7天耳中動脈采血，用間接ELISA和間接競爭ELISA法檢測抗血清效價和特異性，待血清效價和特異性穩(wěn)定后，進(jìn)行抗血清的采集?？寡逵眯了幔蛩徜@兩步法純化。

1．5 抗血清的效價及特異性測定 將包被原按預(yù)試的1μg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，將純化好的抗血清 1 ∶10000、1 ∶20000、1 ∶40000、1 ∶80000、1 ∶160000、1 ∶320000 、1 ∶640000、1 ∶1280000 倍比稀釋，用間接ELISA測定抗血清的效價，用間接競爭ELISA測定抗血清的特異性。選擇效價高且抑制效果好的抗血清，根據(jù)方陣滴定以O(shè)D450nm值在1．0左右的稀釋度作為抗血清的工作濃度，將AOZ稀釋成濃度為 0、0．5、1．5、4．5、13．5、40．5、121．5 ng/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，建立間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將AOZ結(jié)構(gòu)類似物呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物，按AOZ標(biāo)準(zhǔn)品相同的方法稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，進(jìn)行間接競爭ELISA檢測，得出其半抑制濃度(IC50)值，計(jì)算它們與AOZ的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=(AOZ IC50/結(jié)構(gòu)類似物IC50)×100%。

2 結(jié)果

2．1 半抗原結(jié)構(gòu)鑒定 半抗原的分子量為234，分子離子峰為235(圖4)，表明目標(biāo)化合物合成成功，且純度大于85%，能達(dá)到偶聯(lián)要求。

圖4 半抗原質(zhì)譜圖

2．2 完全抗原鑒定 由紫外分光光度計(jì)鑒定完全抗原。由圖5可見，半抗原在272 nm處、BSA在278 nm處有最大吸收，而完全抗原紫外掃描圖不同于半抗原和BSA，完全抗原偶聯(lián)了一定數(shù)量的半抗原，在最大吸收波長發(fā)生明顯偏移，從而初步判定偶聯(lián)成功。

圖5 完全抗原紫外掃描

2．3 抗血清的檢測 第4次免疫后，檢測出有AOZ特異性抗體產(chǎn)生，抗體效價為1280000，結(jié)果見表1。以O(shè)D值在1．0左右的稀釋度作為抗體工作濃度，將243 ng/mL的AOZ標(biāo)準(zhǔn)液稀釋建立間接競爭 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，線性方程為:y=－12．2 Ln(x)+98．88，R2=0．994，x 表示待測物濃度，y表示抑制率，計(jì)算得 IC50為 5．9 ng/mL，在1～27 ng/mL呈線性關(guān)系，以相同方法對抗血清的交叉反應(yīng)性進(jìn)行測定，對結(jié)構(gòu)類似物AMOZ、AHD、SEM的交叉反應(yīng)率分別為 0．76%、0．02%、0．02%、0．83%。

表1 AOZ抗血清的效價

圖6 AOZ間接競爭ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

AOZ屬小分子半抗原，不具有免疫原性，需與載體蛋白偶聯(lián)以合成人工完全抗原，因而制備出有效的完全抗原是制備AOZ特異性抗體的關(guān)鍵。目前制備呋喃唑酮代謝物抗原的常用方法是將AOZ的氨基和對羧基苯甲醛的醛基縮合反應(yīng)合成半抗原CPAOZ，偶聯(lián)蛋白后制備完全抗原，此種方法制備的抗CPAOZ單克隆抗體IC50可達(dá)0．30 ng/mL，但是對 AOZ卻沒有特異性［9－10］，這樣在檢測過程中就要將待檢物AOZ衍生化為CPAOZ，此過程操作繁瑣，耗時長，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。本方案也引入了對羧基苯甲醛，但是還原了C=N雙鍵，以減小共軛結(jié)構(gòu)對抗原活性的影響，保證抗AOZ特異性抗體的產(chǎn)生，而非是CPAOZ特異性抗體。也曾嘗試過在AOZ的氨基上引入4－溴丁酸乙酯或者丁二酸酐作為間隔臂，但是可能由于改造過的半抗原分子量過小，分子的空間結(jié)構(gòu)過于簡單，未能得到高效價和高特異性的抗體。

本研究成功制備了半抗原，與BSA偶聯(lián)后，經(jīng)紫外掃描對抗原的偶聯(lián)情況進(jìn)行鑒定，半抗原與載體的偶聯(lián)比為16∶1。一般認(rèn)為偶聯(lián)比在5∶1～30∶1范圍內(nèi)能產(chǎn)生較好的特異性抗體［11－12］。本實(shí)驗(yàn)得到的偶聯(lián)比為16，通過免疫新西蘭大白兔得到了較高靈敏度的抗血清，與結(jié)構(gòu)非常相近的呋喃它酮代謝物幾乎沒有交叉反應(yīng)，其IC50為5．9 ng/mL，雖然與目前已報(bào)道的檢測方法的靈敏度有較大差距，但這是對硝基呋喃代謝物的快速檢測方案優(yōu)化的新嘗試。此方案對抗原合成和抗體制備還需進(jìn)一步的研究和探索。

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