李圓菲，鄭曉斌，周文英，黃 瑾＊

（1．長沙市中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙410008；2．中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海519000）

肺炎球菌一直是全球范圍肺部感染最常見的致病菌，占社區(qū)獲得性肺炎的第一位，肺炎鏈球菌肺炎是引起成年人CAP（Community Acquired Pneumonia，社區(qū)獲得性肺炎）最常見的病因，被認(rèn)為是人類的重要致病菌，波及范圍極廣，在歐洲和美國占需住院CAP患者的30%－50%［1］，在我國年齡大于60歲的老年人中為33．4%，兒童占38．2%［2－3］。嚴(yán)重危害人類健康。肺炎球菌為革蘭陽性雙球菌，莢膜多糖為其主要的致病因子，根據(jù)其莢膜不同的組成成分，定義出91種血清型。PPV23（Pneumococcal Polysaccharide Vaccine 23，23價(jià)莢膜多糖肺炎球菌莢膜多糖疫苗），這種疫苗是0．5ml中包括了23種血清型提純的肺炎球菌莢膜多糖，這23種血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、20、22F、23F和33F，每種血清型25μg，這些血清型涵蓋了美國和其他一些發(fā)達(dá)國家成年人侵襲性肺疾病的85%－90%，并包括了大多數(shù)耐藥血清型［1］。覆蓋了我國71．9%的分離肺炎球菌菌株的血清型［4］。其廣泛推薦在有某些對肺炎球菌易感因素的成年人和大于2歲的兒童中使用，這些因素包括有慢性心、肺、肝臟等疾病。

不同人群在自然狀態(tài)下對肺炎球菌應(yīng)答情況及應(yīng)答過程中產(chǎn)生抗體量的情況目前暫不完全清楚。本研究通過間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測人體血清中的抗肺炎球菌莢膜多糖IgG，IgM，了解健康人群、CAP患者在自然狀態(tài)下免疫應(yīng)答的水平。

1 資料與方法

1．1 研究對象 實(shí)驗(yàn)中CAP患者，健康對照組血液標(biāo)本為2010年8月至2012年3月我院呼吸內(nèi)科就診患者，采血均知情同意，健康人組為同期我院體檢科體檢自愿者。健康人組男13名，女17名，平均年齡為（39．77±5．89）歲。納入研究的CAP組包括男19名，女13名，平均年齡為（46．28±22．2）歲。CAP診斷：（1）符合CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2006年制定的CAP診斷和治療指南［5］；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦；明確或高度懷疑肺結(jié)核患者；支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病等原發(fā)肺基礎(chǔ)疾病。

1．2 標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室參考血清制備 用促凝管抽取血液約4ml，在離心機(jī)中以3 000轉(zhuǎn)／分，離心5分鐘，取血清封裝于高壓滅菌的離心管中，保存于－70℃冰箱中備用。將50名等量健康人血清混勻制成實(shí)驗(yàn)室參考血清。實(shí)驗(yàn)過程中探測疫苗最佳包被濃度、最佳血清稀釋度等分裝于滅菌安瓿中－70℃保存。

1．3 主要儀器及試劑 酶標(biāo)儀（BIO－TEK INSTRUMENTS．INC公司）；96孔ELASISA聚苯乙烯板（廣州威佳生物公司）；23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗（紐莫法，美國默沙東公司）；小牛血清白蛋白（BSA，杭州四季清公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗人IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗人IgM（武漢博士德生物工程有限公司）；H2O2／TMB底物（北京萬泰生物藥業(yè)有限公司）；包被緩沖液（PBS）；洗滌液：0．05%Tween20磷酸鹽緩沖液（PBST）；抗體緩沖液：含1%BSA 的0．05%Tween磷酸鹽緩沖液（PBST）。

1．4 研究方法 本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)WHO發(fā)布的關(guān)于《ELISA法定量測定抗肺炎球菌莢膜多糖血清特異性IgG 抗體培訓(xùn)手冊》（Training mannual for Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG Pn PS ELISA）［6］及根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。通過棋盤滴定得出檢測不同類型抗體最佳抗原包被濃度、血清稀釋倍數(shù)及酶標(biāo)二抗?jié)舛取?/p>

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)上有顯著性差異。

1．6 結(jié)果記錄

結(jié)果中記錄OD值為復(fù)孔算術(shù)平均值與最高空白對照值的差，最高空白對照值控制在0．01以下。每塊酶標(biāo)板以實(shí)驗(yàn)室參考血清稀釋倍數(shù)及相應(yīng)OD值做擬合曲線，R2為0．990±0．003，以擬合方程計(jì)算結(jié)果，以樣本血清抗體濃度相對參考血清的抗體濃度的比值來表示結(jié)果。

2 結(jié)果

CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白IgM高于健康人，但P值為0．109，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白IgG高于健康人，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P＜0．01），見表1。

表1 各組血清抗肺炎球菌莢膜多糖IgM、IgG值

3 討論

肺炎球菌莢膜多糖抗原為TI抗原，進(jìn)入機(jī)體后在48小時(shí)內(nèi)，即與B1細(xì)胞表面的BCR結(jié)合，通過受體交聯(lián)使后者活化，分化成抗體分泌細(xì)胞，并迅速分泌IgM抗體，直接或通過補(bǔ)體經(jīng)調(diào)理作用清除病原體。IgM是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，血清檢出IgM提示新近發(fā)生感染。

肺炎球菌莢膜多糖為TI－2抗原，其免疫應(yīng)答機(jī)制尚未完全闡明。普遍認(rèn)為，TI－2抗原存在大量重復(fù)抗原表位，能激活補(bǔ)體旁路途徑和凝集素途徑，刺激成熟B1細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞。TI－2抗原表位與BCR相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，提供第一信號，同時(shí)通過其重復(fù)性抗原表位使BCR發(fā)生交聯(lián)，提供第二信號，從而激活B細(xì)胞，應(yīng)答過程不需T細(xì)胞的輔助。一般認(rèn)為，針對TI－2抗原的應(yīng)答只產(chǎn)生IgM抗體，不發(fā)生Ig類別轉(zhuǎn)換，也不產(chǎn)生記憶性B細(xì)胞。但也有證據(jù)顯示，T細(xì)胞的輔助可以增強(qiáng)B細(xì)胞對TI－2抗原的應(yīng)答，并誘導(dǎo)抗體類別轉(zhuǎn)換，這一過程與Th細(xì)胞激活釋放的某些細(xì)胞因子有關(guān)，這些細(xì)胞因子作用于B細(xì)胞后不僅增強(qiáng)抗體應(yīng)答，且促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換［7］。

本研究提示，CAP患者在感染初期抗肺炎球菌IgM抗體水平明顯升高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道社區(qū)獲得性肺炎常見病原菌為肺炎球菌相符［8］。健康人血清存在一定量的抗肺炎球菌莢膜多糖IgM抗體，其值總體偏低，可能與肺炎球菌定植有關(guān)。在一般情況下，機(jī)體對肺炎球菌存在一定的抵抗力，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、免疫抑制及病原菌異位時(shí)就會(huì)引起機(jī)體感染。

本研究結(jié)果表明，健康人血清中存在抗肺炎球菌莢膜多糖IgG抗體，且在健康人群中其濃度符合正態(tài)分布，提示人體感染肺炎球菌是一種普遍現(xiàn)象，或人體在自然狀態(tài)下能對寄生狀態(tài)下的肺炎球菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且可形成免疫記憶。這與相關(guān)文獻(xiàn)中提到TI抗原能產(chǎn)生免疫記憶相一致［7］。

CAP患者抗肺炎球菌莢膜多糖IgG抗體水平高于健康人，符合再次免疫機(jī)體體液免疫應(yīng)答的一般規(guī)律，即產(chǎn)生的抗體以IgG為主，且抗體應(yīng)答迅速，峰值高。由于肺炎球菌長期定植于人體鼻咽部，CAP患者既往多次感染多種血清型肺炎球菌并可能已對本次致病的肺炎球菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答，形成免疫記憶，當(dāng)機(jī)體再次感染同種血清型肺炎球菌莢膜多糖時(shí)即產(chǎn)生高滴度的IgG抗體。其特異性IgG抗體濃度高于健康人。根據(jù)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的一般規(guī)律，二次應(yīng)答的能力可持續(xù)存在數(shù)個(gè)月或數(shù)年，故機(jī)體一旦感染后可持續(xù)相當(dāng)時(shí)間不再感染相同病原體［9］。表明機(jī)體在自然狀態(tài)下存在對肺炎球菌有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答能力，且TI抗原可以引起機(jī)體免疫記憶。據(jù)此可得出結(jié)論，CAP患者能在自然感染過程中產(chǎn)生一定量抗肺炎球菌莢膜多糖抗體，且此類抗體能持續(xù)較長時(shí)間具有保護(hù)作用，是否需要予以健康人常規(guī)進(jìn)行肺炎球菌莢膜多糖疫苗接種需進(jìn)一步研究。

［1］123－valent pneumococcal popysaccharide vaccine WHO position paper Weekly Epidemiological Record［OL］．2008，83：373－384 http：／／www．who．int／wer．

［2］龐小芬，吳秀琳．老年社區(qū)獲得性肺炎150例臨床分析［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2004，20（18）：1852．

［3］袁 藝，王天有，陳慧中，等．兒童院內(nèi)及社區(qū)獲得性肺炎病原菌和藥敏試驗(yàn)及分析［J］．中國實(shí)用兒科雜志，2003，18（10）：623．

［4］羅小銘，胡右嬋，梁建平，等．肺炎鏈球菌的耐藥性及血清型分布調(diào)查［J］．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，10（6）：835．

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)．社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南［J］．中華結(jié)核呼吸雜志，2006，29：651．

［6］Training mannual for Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG（Pn PS ELISA）．2011［1－20］［OL］．www．vaccine．uab．edu．

［7］周光炎．免疫學(xué)原理［J］．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007：188－189．

［8］索玉潔．社區(qū)獲得性肺炎病原菌及耐藥性分析［J］．中國初級衛(wèi)生保健，2010，24（4）：276．

［9］Hancock DB，Eijgelsheim M，Wilk JB，et al．Meta－analyses of genome－wide association studies identify multiple lociassociated with pulmonary function［J］．Nat Genet，2010，42（1）：45．