王 玥，薛 露，馬 翠，何永艷，孫鴻雁，李春懷

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒血液腫瘤科，吉林 長春130021）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常被認(rèn)為是免疫介導(dǎo)的造血功能衰竭，先前的研究證實AA患者存在免疫細(xì)胞及分子異常導(dǎo)致的造血干細(xì)胞及骨髓 MSC的功能損傷［1，2］，導(dǎo)致紅骨髓總?cè)萘繙p少，代以脂肪髓，臨床以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征。

GATA－2為轉(zhuǎn)錄因子GATA家族成員，亦屬鋅指結(jié)構(gòu)家族，可識別和結(jié)合靶基因的特異性［T／A（GATA）A／G］序列并因此得名。在早期造血干／祖細(xì)胞及 MSCs中均有表達(dá)，并調(diào)節(jié)其增殖、分化［3，4］，是調(diào)節(jié)正常造血重要的轉(zhuǎn)錄因子，過去關(guān)于GATA－2與AA相關(guān)機(jī)制的研究主要集中于GATA－2表達(dá)下調(diào)對造血干細(xì)胞的影響［5］，而很少有報道骨髓造血微環(huán)境中骨髓MSCs的GATA－2表達(dá)情況。為了探討GATA－2在AA兒童治療前后骨髓MSC的表達(dá)水平變化及其在AA發(fā)病機(jī)制中可能的作用，我們采用QRT－PCR法對38例AA患兒和20例正常對照組骨髓MSC GATA－2表達(dá)進(jìn)行檢測。

1 材料和方法

1．1 研究對象

2008年10月至2011年10月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒血液科收治的38例AA患兒均為重癥AA，所有病例均經(jīng)過外周血象、骨髓象、骨髓活檢，符合再障診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)［6］。其中男20例，女18例，年齡2－13歲，平均7歲。正常對照組20例來自于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查正常的非血液病患兒，其中男9例，女11例，年齡2－12歲，平均5歲。38例患兒中30例接受免疫抑制治療（環(huán)孢素、雄激素），其中7例曾應(yīng)用ATG治療，療效評價按照1987年第四屆全國再生障礙性貧血學(xué)術(shù)會議修訂的療效標(biāo)準(zhǔn)［7］，對治療有反應(yīng)組包括為療效基本治愈、緩解、明顯進(jìn)步的患兒，22例獲得治療2年骨髓標(biāo)本，8例失訪，12例患者獲得緩解。患者及正常志愿者對試驗方案均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后收集經(jīng)肝素抗凝的骨髓液4ml。

1．2 主要試劑及儀器

淋巴細(xì)胞分離液（天津TBD公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶 （Hyclone公司）；Trizol試劑、所有引物（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（日本TaKa－Ra公司）；流式細(xì)胞儀 （Becton Dickinson Biosciences公司）；熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體（BD公司）。

1．3 MSC的培養(yǎng)

取髂后上棘部位骨髓液4ml（肝素抗凝），用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（密度1．077）按密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞。把1×107單個核細(xì)胞／ml加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中［MesenCult Basal Medium，包括人間充質(zhì)干細(xì)胞富集試劑］，在25cm2的塑料培養(yǎng)瓶（CELLSTAR，Germany），于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2及飽和濕度）中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h棄去培養(yǎng)液上清加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)80%瓶壁面積，用適量PBS液沖洗，以0．25%（w／v）胰蛋白酶溶液消化貼壁細(xì)胞。將消化的貼壁細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。第3代MSC用于后續(xù)試驗。

1．4 MSC的鑒定

FACS Caliber流式細(xì)胞儀檢測MSC免疫抗體表達(dá)。第3代MSC胰蛋白酶消化沖洗后，1×105細(xì)胞加入5μg單克隆抗體，4℃，30min。以PBS（含1%胎牛血清）沖洗細(xì)胞，重懸于300μl PBS液中待檢。采用流式細(xì)胞儀檢測第3代MSCs表面標(biāo)志CD29，CD44，CD45，CD34，CD90，CD105表達(dá)水平。熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體購于BD公司，以同型IgG作為陰性對照，結(jié)果用CellQuest軟件分析。

1．5 RNA提取和cDNA合成

總RNA的提取：選擇生長狀態(tài)較好的3代MSCs和 AA－MSCs，按每105－106個細(xì)胞加入 Trizol裂解液1ml，裂解后加入0．2ml氯仿，離心后吸取上清，加入0．5ml異丙醇，離心沉淀后棄上清，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌沉淀，最后加入適量1g／L DEPC處理過的無菌雙蒸水溶解RNA。cDNA反轉(zhuǎn)錄合成：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μl，包括標(biāo)本RNA 1μg，隨機(jī)引物100ng和反轉(zhuǎn)錄酶等。

1．6 引物設(shè)計與合成

從美國生物技術(shù)信息中心（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）的 Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索 GATA－2基因 （ACCESSION M77810）和 GAPDH 基 因（HS99999905＿m1）的 mRNA序列。參照文獻(xiàn)［8］中的引物序列設(shè)計上下游引物，并運用美國Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所基因組研究中心（http：／／www．genome．wi．mit．edu）提供的Primer3程序設(shè)計探針，由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成Taqman熒光探針。在ABI 7300實時定量PCR儀上進(jìn)行實時定量擴(kuò)增。

1．7 實時定量PCR

為保證PCR擴(kuò)增的有效性及分析的準(zhǔn)確性，從AA患者及正常人 MSCs中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行GATA－2和GAPDH的實時擴(kuò)增并得到 Ct值，Ct值（cycle threshold）即 PCR 擴(kuò)增過程中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長期的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，基因表達(dá)量的計算方法采用上?；瞪锛夹g(shù)有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計算待測樣本中基因表達(dá)量。PCR循環(huán)條件參見說明書。

1．8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用 Mean±SD表示，各個組間GATA－2／GAPDH比例采用t檢驗。采用 SAS 9．1統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0．05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

骨髓中分離MSCs接種于培養(yǎng)瓶中，24h后即可觀察到少量貼壁細(xì)胞生長，48h后去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，原代細(xì)胞形態(tài)不均一，第3代細(xì)胞鋪滿瓶底后呈長梭形、漩渦狀分布，形態(tài)均一（圖1）。

2．2 MSCs的表面標(biāo)志

比較AA患者M(jìn)SCs與正常人MSCs的表面標(biāo)志，結(jié)果顯示兩者無明顯差異，均不表達(dá)CD34，CD45，表達(dá)CD29、CD90、CD105及CD44（圖2）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）（×100）

2．3 再生障礙性貧血患者和正常人MSCs中GATA－2基因的表達(dá)水平比較（圖3）

來自于AA兒童和正常對照組骨髓MSC傳代至第三代時，經(jīng)實時定量PCR檢測GATA－2基因表達(dá)。AA兒童治療前 MSC GATA－2基因表達(dá)水平與正常對照相比，明顯減低（P＜0．05）；免疫抑制治療2年后對免疫抑制治療有反應(yīng)的AA兒童GATA－2表達(dá)水平高于發(fā)病時，且與正常對照組表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。對免疫抑制治療無反應(yīng)的AA兒童GATA－2表達(dá)水平低于于發(fā)病時和正常對照組GATA－2表達(dá)水平（P＜0．05）。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）表面標(biāo)志

圖3 再生障礙性貧血患者免疫治療前后和正常人間充質(zhì)干細(xì)胞中GATA－2基因的相對表達(dá)量比較

3 討論

骨髓MSCs是造血微環(huán)境的主要成分，具有自我更新及增殖能力，通過介導(dǎo)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells HSCs）的黏附，分泌多種造血生長因子而發(fā)揮造血支持作用［9，10］，且具有調(diào)節(jié)免疫及維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用。多項研究證實AA患者骨髓 MSCs存在生物學(xué)性質(zhì)異常［11，12］，例如增殖能力的下降，易于分化形成脂肪細(xì)胞等。

GATA－2是調(diào)節(jié)正常造血的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其穩(wěn)定和平衡對于維持正常造血十分重要，在正常的造血過程中，隨著造血細(xì)胞的分化及成熟，GATA－2的表達(dá)下調(diào)可以阻止正常造血細(xì)胞的增殖和分化［13，14］。過去關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子 GATA－2與 AA 的發(fā)病機(jī)制的研究主要從造血干細(xì)胞方面著手，近年來隨著骨髓MSCs分離及培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，少數(shù)研究者開始關(guān)注AA患兒骨髓 MSCs的GATA－2表達(dá)情況，我們前期研究發(fā)現(xiàn)AA患兒病初MSCs中 GATA－2表達(dá)明顯低于正常［16］，這與文獻(xiàn)［15］報道一致，提示GATA－2的異常表達(dá)在AA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步證實GATA－2的表達(dá)變化在兒童AA的發(fā)病機(jī)制中作用，本文從轉(zhuǎn)錄水平上研究了AA患兒治療前后骨髓MSCs中GATA－2基因表達(dá)變化情況。

研究結(jié)果表明AA患兒病初GATA－2基因表達(dá)水平明顯低于正常兒童，且經(jīng)免疫抑制治療2年后，對免疫治療有反應(yīng)的患兒該基因表達(dá)水平較前明顯提高，且治療后該基因表達(dá)水平與正常對照組表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差別（P＞0．05）；而對免疫治療無反應(yīng)的患兒該基因表達(dá)水平較病初無明顯變化，這一研究結(jié)果提示AA患兒體內(nèi)的GATA－2基因表達(dá)異常參與發(fā)病過程及與AA患兒體內(nèi)免疫異常密切相關(guān)。

GATA－2在早期造血干／祖細(xì)胞中表達(dá)，隨著造血細(xì)胞分化、發(fā)育成熟，GATA－2表達(dá)下調(diào)。GATA－2在體內(nèi)的表達(dá)有嚴(yán)格的“劑量依賴”效應(yīng)，GATA－2的表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞分化是必需的［18］。正常人骨髓中有GATA－2的低表達(dá)，在各類白血病患者中，GATA－2的表達(dá)增高。GATA－2在白血病中的高表達(dá)反映了造血干／祖細(xì)胞分化、發(fā)育阻滯，幼稚白血病細(xì)胞增多。反之，AA患兒骨髓造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中GATA－2表達(dá)均下調(diào)，提示兩者增殖、分化能力下降，支持AA的造血干細(xì)胞數(shù)量和功能缺陷理論。

轉(zhuǎn)錄因子GATA－2可通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)而調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，其表達(dá)下降可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化加速，脂肪細(xì)胞形成增多［4］，文獻(xiàn)［16，17］研究表明AA患者 MSCs體外培養(yǎng)過程中易于向脂肪細(xì)胞分化，上述結(jié)果均支持臨床中AA患兒骨髓脂肪化這一事實。

另外，本研究表明對免疫抑制治療有效的患兒治療后GATA－2表達(dá)較病初明顯升高，而治療無效的患兒該基因表達(dá)較發(fā)病時無明顯變化，提示GATA－2基因表達(dá)異常與AA患兒體內(nèi)免疫異常密切相關(guān)。IFN－γ在AA的免疫異常中發(fā)揮重要作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)AA患兒發(fā)病時PPARγ表達(dá)升高，且IFN－γ抑制GATA－2的表達(dá)，AA患兒經(jīng)過免疫抑制治療后GATA－2表達(dá)升高，此時是否存在PPARγ表達(dá)的降低，這一點尚需進(jìn)一步證實。且IFN－γ與GATA－2之間的關(guān)系及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了GATA－2基因在AA患者M(jìn)SCs的表達(dá)明顯低于正常人MSCs的表達(dá)，其差異有顯著性意義，且經(jīng)免疫治療效果好的患兒該基因表達(dá)水平與正常人無明顯差異，提示在AA發(fā)病機(jī)制的微環(huán)境改變中除MSCs的免疫異常外，GATA－2基因通過其與MSCs的相互作用也參與了對微環(huán)境的調(diào)控，這為了解MSCs在造血因子和成脂調(diào)控中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)，其相互作用關(guān)系及具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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