郭鵬德，馬慶杰，王振常，高 識(shí)，紀(jì)鐵鳳

（1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京100730；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 吉林 長春130033）

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%［1］。腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高，受多種蛋白分子調(diào)控，包括整合素αvβ3，其在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織不表達(dá)或低表達(dá)［2］，而在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面及多種惡性腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)顯著增加。腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞為遺傳穩(wěn)定性的非惡性內(nèi)皮細(xì)胞，其表面的整合素αvβ3受體沒有突變的可能，而且其在這些細(xì)胞表面直接接觸循環(huán)血液，易于接近藥物，適用于作為腫瘤治療的靶，但整合素αvβ3在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)情況尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)整合素αvβ3在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)情況，分析其與腦膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系，為進(jìn)一步整合素αvβ3的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1．1 病理資料 20例腦膠質(zhì)標(biāo)本來源于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，其中男12例，女8例，年齡范圍26－68歲（平均40．87±12．9歲）（表1），所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療，術(shù)后均經(jīng)病理診斷為腦膠質(zhì)瘤。術(shù)后病理標(biāo)本行常規(guī)HE染色，并按照《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類》（2007）標(biāo)準(zhǔn)［3，4］進(jìn)行分類。每例切片均經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生對(duì)微血管密度和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。依據(jù)術(shù)后病理檢查結(jié)果，將患者分為低度惡性組（low malignant group，LM）（Ⅰ－Ⅱ級(jí)）和高度惡性組（high malignant group，HM）（Ⅲ－Ⅳ級(jí)）。

1．2 主要試劑 抗αvβ3生物素單克隆抗體購自Chemicon Europe公司，10%中性甲醛、PBS緩沖液、乙醇、二甲苯、石蠟、蒸餾水、10%雙氧水、檸檬酸、檸檬酸鈉、氨水、鹽酸、過氧化氫、NaCl、DAB胰酶、蘇木素、中性樹膠、正常山羊血清工作液均購自北京化學(xué)試劑公司。

1．3 免疫組化方法

1．3．1 切片 修剪腫瘤組織，然后切成約0．5cm的薄片，立即投入10%中性甲醛－PBS緩沖液內(nèi)，在4℃溫度下固定24h；應(yīng)用TISSUE—TEKVIP TEC包埋機(jī)自動(dòng)包埋；在LEICA SM 2000R切片機(jī)中連續(xù)切片，厚度3μm；在80℃ 條件下烤片1h，60℃過夜。

1．3．2 免疫組織化學(xué)技術(shù) 將烤好的切片常規(guī)脫蠟水化，10%雙氧水處理10min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。用0．1MPBS洗滌3次，每次10min。滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育30 min，傾去；滴加1∶100將抗αvβ3生物素單克隆抗體LM609，室溫孵育1h；0．1MPBS洗滌3次（每次10min）。滴加0．04%DAB 1ml與1μl 30%過氧化氫混合液顯色，用鏡下控制抗體顯色時(shí)間，以流水進(jìn)行洗滌終止顯色反應(yīng)。然后蒸餾水浸泡3 min，蘇木素復(fù)染1min，經(jīng)鹽酸酒精分化，氨水反藍(lán)后，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察染片情況，照相。

1．4 結(jié)果判斷 每例切片均經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生對(duì)微血管密度和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。免疫組化采用雙盲讀片，高倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)取4個(gè)視野，αvβ3受體染色以棕黃色顆粒、背景清晰為陽性表達(dá)?！皑C”為無細(xì)胞著色，“＋”為低度表達(dá)，“＋＋”為中度表達(dá)，“＋＋＋”為高度表達(dá)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料結(jié)果以ˉx±s表示，采用相關(guān)性分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Peason及Spearman等級(jí)相關(guān)分析；顯著性水平＝0．05，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 16．0。

2 結(jié)果

整合素αvβ3表達(dá)情況與患者年齡、性別、腫瘤部位等無關(guān)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜、胞質(zhì)、血管內(nèi)皮及腫瘤周圍浸潤組織，呈棕黃色顆粒（圖1）。腫瘤周圍水腫、正常及壞死組織未見αvβ3表達(dá)。

10例低度惡性膠質(zhì)瘤中，αvβ3中度表達(dá)4例，低度表達(dá)6例；10例高度惡性膠質(zhì)瘤中，αvβ3高度表達(dá)9例，中度表達(dá)1例 （表1、表2）。高度惡性組αvβ3的表達(dá)高于低度惡性組，兩組間存在顯著性差異（χ2＝16．80，P＝0．000，P＜0．05）。

表1 HE染色及整合素αvβ3表達(dá)結(jié)果

根據(jù)腫瘤直徑（Td），Td≤2．5cm，2．5cm＜Td≤3．5cm，Td＞3．5cm）分為三組，其與整合素αvβ3表達(dá)情況無明顯相關(guān)性（r＝0．087，P＝0．715，P＞0．05）（表2）。

表2 整合素αvβ3表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑的關(guān)系結(jié)果

圖1 整合素αvβ3表達(dá)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著血管系統(tǒng)的建立、新血管的形成。低度惡性膠質(zhì)瘤血管結(jié)構(gòu)與正常組織接近，而高度惡性膠質(zhì)瘤卻有明顯微血管（即平滑?。苤車?xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞）增生，且密度明顯增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低度惡性膠質(zhì)瘤和正常腦組織。微血管增生的機(jī)制可能有兩種：一是血管生成，通過腫瘤周圍正常腦組織中的毛細(xì)血管出芽而生成。二是通過平滑肌細(xì)胞／血管周細(xì)胞增生和聚集進(jìn)行血管重塑。在血管生成過程中，一系列蛋白調(diào)節(jié)參與，如 VEGF－1、VEGF－2和整合素αvβ3等［5］。

αvβ3是整合素家族的重要一員，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附和移行，在腫瘤生長、局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面有重要作用［6－8］。研究表明［5，9，10］，αvβ3 在新生血管和惡性腫瘤內(nèi)膜表面表達(dá)明顯增加，在成熟血管內(nèi)皮表達(dá)較低。αvβ3作為新生血管和惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)膜的標(biāo)記物，當(dāng)腫瘤向低度分化進(jìn)展、新生血管數(shù)量增加，其表達(dá)也會(huì)迅速增加。應(yīng)用一定數(shù)量的抗αvβ3抗體，可有效阻止腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生長和浸潤。

研究證實(shí)，αvβ3與細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶相互作用，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的周圍浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組化檢測(cè)到αvβ3在不同組織學(xué)分型的腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)不一致，在腫瘤壞死區(qū)、周圍正常組織不表達(dá)，在細(xì)胞膜、胞漿、血管內(nèi)皮和周圍浸潤組織表達(dá)（圖1）；且表達(dá)程度隨腦膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)，在高度惡性組的表達(dá)明顯高于低度惡性組，兩組（HM＆LM）間的表達(dá)存在顯著性差異（χ2＝16．80，P＝0．000，P＜0．05），與其他研究者結(jié)果相同［9，11］。

腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高是由惡性增殖、新血管形成增加和侵襲性生長決定的。腦膠質(zhì)瘤可以沿細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生長。整合素αvβ3在腫瘤周圍組織的表達(dá)提示其在腫瘤細(xì)胞浸潤過程中起重要作用，而且腫瘤浸潤同樣會(huì)使αvβ3表達(dá)增加［12］。在腫瘤周圍組織表達(dá)的可能原因是整合素αvβ3與相關(guān)配體結(jié)合，將細(xì)胞內(nèi)各種蛋白，踝蛋白、鈕蛋白和肌動(dòng)蛋白等定位于某一固定黏附點(diǎn)，從而引起細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，如活化酪氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和生物學(xué)功能。腫瘤浸潤過程中，新血管的生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，同時(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供通道。研究表明［13］，整合素αvβ3可以介導(dǎo)多種生物因子激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，誘導(dǎo)新生血管生成。因此腦膠質(zhì)瘤侵襲性轉(zhuǎn)移的特性與新生血管的形成密不可分，有著共同的生物學(xué)機(jī)制［14］。同時(shí)研究證明［15，16］，整合素 αvβ3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和浸潤過程中起重要作用。因此在本研究中，同樣可以看到αvβ3在新血管和周圍浸潤組織表達(dá)增加（圖1），表明在誘導(dǎo)腫瘤血管生成過程中，整合素αvβ3起重要作用。而且，相關(guān)研究證實(shí)［16］，腫瘤組織學(xué)分級(jí)惡性程度高、細(xì)胞分化低，則腫瘤細(xì)胞侵襲力強(qiáng)、細(xì)胞增殖明顯，αvβ3表達(dá)程度高；惡性程度低、細(xì)胞分化高，則腫瘤細(xì)胞浸潤力低、細(xì)胞增殖不明顯，αvβ3表達(dá)成度低，與本結(jié)果研究一致。

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