張時(shí)良，裴 豪＊，戴亞新，陸 炯

（1．無(wú)錫市傳染病醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫214005；2．東華大學(xué)，上海201600）

核苷（酸）類似物是目前臨床抗病毒治療的常用藥物，但由其引起的耐藥問(wèn)題也日益突出。很多研究［1－3］表明，與拉米夫定耐藥相關(guān)的基因突變有逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）基因區(qū)的 M204I／V／S、L180M、V173L等；與阿德福韋耐藥相關(guān)的突變 位 點(diǎn) 有 N236T、A181V／T、I233V、V214A、Q215S、L217R等；與恩替卡韋耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)有S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L 等；與替比夫定耐藥相關(guān)的突變?yōu)镸204I等。為獲得一種可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)以上耐藥突變位點(diǎn)的方法，本實(shí)驗(yàn)采用由上海東華大學(xué)提供的多重聚合酶連接反應(yīng)－連接酶檢測(cè)反應(yīng)分型法（PCR－LDR）對(duì)50例樣本進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)分析，以驗(yàn)證該方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣本來(lái)源 2010年5月1日至31日在本院就診并運(yùn)用核苷類藥物治療的慢性乙型肝炎患者50例，其中男性33例，女性17例，年齡15至69歲，平均年齡42．83±13．47歲。

1．1．2 主要試劑和儀器 HBV DNA熒光定量試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司，引物、探針由上海東華大學(xué)合成，電泳膠、緩沖液、內(nèi)參試劑均購(gòu)自美國(guó)ABI公司；所用儀器為ABI 7500Real－Time PCR System，ABI PRISM 3130DNA Sequencer購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1．1．3 引物設(shè)計(jì) 以基因庫(kù)公布的981條HBV基因序列為基礎(chǔ)，在RT區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)通用引物PCR1－upper，PCR1－lower 和 PCR2－upper，PCR2－lower（表1）。

1．2 方法

1．2．1 特異性寡核苷酸探針的設(shè)計(jì) 針對(duì)拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋8個(gè)耐藥位點(diǎn)的氨基酸替換形式，設(shè)計(jì)包括rtL180M、YMDD／YIDD／YVDD、rtA181V／T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtS202I、rtM250V的8條特異性檢測(cè)探針（表2）。

表1 PCR引物序列

1．2．2 血清HBV DNA的抽提 按照上?？迫A生物工程公司試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．3 反應(yīng)條件 以血清提取物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。20μl PCR反應(yīng)體系含Taq酶1U，10X緩沖液2μl，2mMdNTP 2μl，2pmol／μl引物2μl，50 mM Mg2＋1．2μl。第一輪PCR模板為血清提取物2μl，引物為PCR1－upper、PCR1－lower、PCR2－upper、PCR2－lower，反應(yīng)條件為95℃15min；94℃30 s，54℃30s，72℃30s，45個(gè)循環(huán)；72℃5min；第二輪10μl LDR反應(yīng)體系模板為第一輪PCR產(chǎn)物2 μl，10X緩沖液1μl，2pmol／μl探針1μl，反應(yīng)條件為94℃2min；94℃30s，55℃ 2min，15個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物保存于4℃待用。

1．2．4 測(cè)序 PCR－LDR 產(chǎn)物使用 ABI PRISM 3130DNA Sequencer進(jìn)行產(chǎn)物分析，樣本直接測(cè)序由上海博尚技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持。

2 結(jié)果

2．1 PCR的靈敏度和特異性 以不同HBV DNA濃度的血清提取物為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，終檢濃度為103copies／ml（熒光定量試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司）。陽(yáng)性樣本的最終PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期值相符（PCR1－upper，low引物對(duì)的擴(kuò)增物為248bp，PCR2－upper，low為231bp）。

2．2 HBV野生標(biāo)準(zhǔn)株的鑒定 為避免突變探針產(chǎn)生非特異性的突變信號(hào)，應(yīng)用直接測(cè)序法和PCRLDR法分別對(duì)HBV野生標(biāo)準(zhǔn)株分析，結(jié)果顯示，野生株在目的區(qū)段未發(fā)生耐藥突變（圖1）。由于臨床恩替卡韋耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)為S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L，其中又以 T184G／A／L 為主［4］，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)到1例184位點(diǎn)突變。

表2 探針的名稱和序列

圖1 HBV野生標(biāo)準(zhǔn)株LDR法結(jié)果

2．3 臨床樣本血清PCR產(chǎn)物分析 選取的50例HBV DNA血清樣本中，35例樣本未檢測(cè)到耐藥突變，8例為拉米夫定耐藥突變，5例為阿德福韋耐藥突變，1例為拉米夫定和阿德福韋同時(shí)耐藥突變，1例恩替卡韋耐藥突變病毒株。將PCR－LDR法的檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序法所得結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（圖2），由圖2可知其結(jié)果完全一致。由此可初步證實(shí)本方法的臨床可行性，可用于目前HBV抗病毒治療藥物耐藥的檢測(cè)。

3 討論

迄今慢性HBV感染為全球性的難題，全世界約有3．5億人感染，預(yù)知相關(guān)的年死亡人數(shù)約為1 200 000［5］。因此針對(duì) HBV 的抗病毒治療受到廣泛重視。隨著對(duì)HBV聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能的深入認(rèn)識(shí)，一些有效抑制HBV DNA復(fù)制的核苷類藥物（如拉米夫定、替比夫定、阿德福韋、恩替卡韋等）逐步成為抗HBV治療的新選擇［6，7］。由于HBV聚合酶如同其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶一樣具有較高的錯(cuò)配傾向且缺乏校對(duì)能力，因此隨著感染的持續(xù)病毒準(zhǔn)種逐年增多［8，9］。在核苷類藥物的選擇壓力下，耐藥變異株逐漸增多，最終替代野生株成為優(yōu)勢(shì)株，從而導(dǎo)致臨床耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。

目前臨床檢測(cè)HBV耐藥的方法主要有直接測(cè)序發(fā)、實(shí)時(shí)熒光PCR和反向雜交法［10］。但這些方法都有其不足之處：直接測(cè)序法可以檢測(cè)HBV已知和未知的突變，但對(duì)于低滴度的樣本（小于104copies／ml）無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)小于野生株20%的低豐度耐藥株序列容易被忽略，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)；實(shí)時(shí)熒光PCR不能同時(shí)檢測(cè)多位點(diǎn)突變，應(yīng)用受到限制；反向雜交法反應(yīng)步驟繁雜，應(yīng)用成本較高，試驗(yàn)周期也較長(zhǎng)。

圖2 HBV耐藥株直接測(cè)序和PCR－LDR法比對(duì)結(jié)果

我們采用PCR－LDR法構(gòu)建一次性檢測(cè)HBV核苷類藥物耐藥的多個(gè)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，將PCR反應(yīng)和LDR反應(yīng)相結(jié)合，擁有PCR的高靈敏度，LDR的高特異性和測(cè)序的高精確度等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，操作簡(jiǎn)便、快速，方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，完全能夠滿足針對(duì)臨床現(xiàn)有常用的核苷類藥物治療HBV耐藥檢測(cè)，為指導(dǎo)臨床使用核苷類藥物治療乙型肝炎患者提供重要的參考依據(jù)。

［1］Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al．Antiviral drug－resistant HBV：standardization of nomenclature and assays and recommendations for management［J］．Hepatology，2007，46：254．

［2］侯金林，孫 劍，王 程．乙型肝炎病毒耐藥變異研究的回顧與展望［J］．中華肝臟病雜志，2007，15：1．

［3］徐東平，周先志．核苷（酸）類似物治療慢性乙型肝炎耐藥研究進(jìn)展［J］．傳染病信息，2007，20：68．

［4］劉 妍，李慶虹，李 樂(lè)，等．慢性HBV感染患者恩替卡韋基因型耐藥突變特征分析［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（6）：621．

［5］Lok AS．Chronic hepatitis B［J］．N Engl J Med，2002，346：1682．

［6］De Clereq E．Anticiral drugs in current clinical use［J］．J Clin Virol，2004，30：115．

［7］Humphries JC，Dixon JS．Antivirals for the treatment of chronic hepatitis B：current and future options［J］．Intervirology，2003，46：413．

［8］Stuyver LJ，Locarnini sa，Lok A，et al．Nomenclature for antiviralresistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region［J］．Hepatology，2001，33：751．

［9］Stuyver L，Van Geyt C，De Gendt S，et al．Line probe assay for monitoring drug resistance in hepatitis B virus－infected patients during antiviral therapy［J］．J Clin Microbiol，2002，38：702．

［10］Keeffe EB，Dieterich DT，Han SH，et al．A treatmen algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States：2008update［J］．Clin Gastroenterol Hepatol，2008，6：1315．