賴允鑫，楊江龍，沙 巍，肖洋炯，曾維宏，葉薇怡，季 萍，肖和平，王 穎＊，沈 浩

（1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海200025；2．同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院，上海200433）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，M．tb）感染引起的傳染病，病原菌主要通過空氣經(jīng)呼吸道傳播。結(jié)核病是目前僅次于AIDS的第二大傳染病殺手，2011年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示全球新發(fā)結(jié)核病患者達(dá)900萬之多，死于結(jié)核病人數(shù)達(dá)140萬［1］；中國(guó)是全世界結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的國(guó)家之一，2011年新增結(jié)核病人數(shù)達(dá)90－110萬，僅次于印度位居世界第二。因此，結(jié)核病的國(guó)內(nèi)外防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻。

結(jié)核病是目前臨床上診斷最為復(fù)雜的疾病之一，現(xiàn)有診斷技術(shù)在診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性上還存在一定的不足。例如，目前在臨床上常規(guī)使用的傳統(tǒng)結(jié)核診斷方法中，痰涂片抗酸染色法（sputum smear microscopy）只有在患者痰中M．tb含量很高的時(shí)候才能檢測(cè)為陽性，因此很容易出現(xiàn)假陰性；痰結(jié)核菌培養(yǎng)法（sputum culture test）能提供更高的準(zhǔn)確性，被譽(yù)為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此法周期長(zhǎng)（三周至兩個(gè)月），培養(yǎng)成功率不高，可能延誤治療；胸部X射線只能檢測(cè)出肺部病變嚴(yán)重的患者（如空洞），而且常常與腫瘤相混淆；基于遲發(fā)型超敏反應(yīng)的PPD皮試試驗(yàn)則由于受檢者接種過BCG而出現(xiàn)假陽性，也很難區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)期結(jié)核病。上述傳統(tǒng)診斷方法的缺陷，使建立可靠高效的TB診斷新技術(shù)成為臨床上的迫切需要。

血清學(xué)診斷是目前臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、便于推廣、無需特殊精密儀器等優(yōu)勢(shì)，并可以發(fā)展成自動(dòng)化檢測(cè)，在腫瘤、自身免疫病、心血管系統(tǒng)疾病、感染性疾病中具有廣泛的運(yùn)用。在結(jié)核病的血清學(xué)診斷方面，國(guó)內(nèi)臨床上使用針對(duì)38kDa、16kDa和LAM 3種抗原的血清學(xué)應(yīng)答水平作為結(jié)核病的輔助診斷指標(biāo)［4，5］，但是其檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度還有待于進(jìn)一步提高。事實(shí)上，世界衛(wèi)生組織（WHO）在對(duì)68項(xiàng)有關(guān)商業(yè)化血清學(xué)試劑盒的研究作出評(píng)估后，發(fā)現(xiàn)這些試劑盒在靈敏度和特異性方面與結(jié)核病的臨床診斷還有一定差距［2］，因此，尋找新的可用于結(jié)核病臨床診斷的血清學(xué)標(biāo)志物仍然是結(jié)核病研究熱點(diǎn)之一。

我們利用實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建和表達(dá)的系列結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白，采用間接ELISA方法比較篩查了活動(dòng)期結(jié)核病患者與健康對(duì)照組血漿中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原的IgG和IgM水平，發(fā)現(xiàn)并探討了抗HSP65的IgG和IgM作為活動(dòng)期結(jié)核病新的血清學(xué)標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象包括50例活動(dòng)期結(jié)核患者和30例正常對(duì)照，50例活動(dòng)期結(jié)核病患者血漿樣本來自上海肺科醫(yī)院，已簽署知情同意書，臨床診斷基于發(fā)病史、體檢、胸部X射線、痰涂試驗(yàn)陽性、分枝桿菌培養(yǎng)陽性等標(biāo)準(zhǔn)，患者基本信息與臨床病理特征見表1。30例正常對(duì)照組血漿樣本來自上海市健康體檢者，篩選的標(biāo)準(zhǔn)是不存在結(jié)核病史，不存在肺部感染。

表1 活動(dòng)期結(jié)核病患者臨床與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（n＝50）

1．2 試劑與材料 BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司，咪唑購(gòu)自生工生物，Ni－NTA His－Bind Resin購(gòu)自QIAGEN公司，IPTG購(gòu)自碧云天，超濾管購(gòu)自Millipore公司，明膠購(gòu)自Sigma公司，氨芐青霉素購(gòu)自Biobasic公司，HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG二抗和山羊抗人IgM二抗均購(gòu)自Southern Biotech公司，鼠抗His－Tag抗體購(gòu)自CST公司，抗鼠IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，TMB底物購(gòu)自BD公司，蛋白印跡顯影液購(gòu)自Millipore公司。

1．3 方法

1．3．1 HSP65和38kD蛋白的表達(dá)與純化pET23b－HSP65和 pET15b－38kD 表達(dá)質(zhì) 粒購(gòu) 自BEI Resources公司，測(cè)序結(jié)果表明目的基因序列與H37Rv菌株的 HSP65（Rv0440）和38kD（Rv0934）序列完全一致。采用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化BL21（DE3）PLySs后，獲得BL21（DE3）PLySs－pET23b－HSP65和BL21（DE3）PLySs－pET15b－38kD 表達(dá)菌株，接種200ml LB培養(yǎng)基（含50μg／ml氨芐青霉素）37℃，250rpm 搖至 OD值為0．4至0．6后，加入IPTG至濃度為0．4mM，在30℃，220rpm條件下誘導(dǎo)3h后，7 000g離心3min，收集沉淀；用20ml細(xì) 菌 裂 解 液 （PBS－1%Triton X－100－10% 甘 油－0．5mM EDTA）重懸菌體沉淀，超聲法充分裂解細(xì)菌；8 000g，4℃離心30min，取上清，經(jīng)0．45μm過濾器過濾后，加入1ml Ni－NTA瓊脂糖微珠，4℃旋轉(zhuǎn)混合過夜；次日用含PBS－20mM咪唑緩沖液充分洗滌，離心棄上清，以去除未與Ni－NTA瓊脂糖微珠結(jié)合或結(jié)合不緊密的雜蛋白；用PBS－300mM咪唑緩沖液洗脫目的蛋白；采用10%SDS－PAGE電泳檢測(cè)純化蛋白純度，收集純度大于95%的純化蛋白經(jīng)3kD超濾管超濾，去除咪唑等小分子；再經(jīng)0．22μm過濾器濃縮過濾后，加入無菌甘油至終濃度為40%，BCA法測(cè)定濃度，并置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 間接ELISA法檢測(cè)血漿中抗 HSP65和38kD抗體 將純化抗原經(jīng)包被液（pH9．6碳酸鹽緩沖液：15mM Na2CO3／35mM NaHCO3，）稀釋至1μg／ml，每孔100μl加入平底96孔板，4℃包被過夜；PBST（PBS－0．05%Tween 20）洗滌3次后，每孔加入200μl PBS－1%明膠，37℃封閉1h；PBST洗3次后，每孔加入100μl血漿稀釋液（采用1%明膠／PBST經(jīng)1∶100稀釋），37℃孵育1h；PBST洗滌6次后，用PBST－1%明膠緩沖液稀釋的HRP－抗人IgG（1∶20 000）和IgM（1∶20 000）二抗，每孔加100μl，37℃孵育1h；PBST洗6次后，每孔加入100μl TMB底物，避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl 2NH2SO4溶液終止顯色反應(yīng)，測(cè)定OD450nm值。

1．3．3 蛋白印跡 采用蛋白印跡鑒定純化抗原的純度，純化蛋白抗原經(jīng)SDS－PAGE電泳，半干印跡至硝酸纖維素膜（NC膜）上，經(jīng)TBS－5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，與經(jīng)TBST－5%奶粉稀釋的鼠抗His－Tag抗體（1∶2 000）4℃孵育過夜；次日，用TBST洗3次，加入經(jīng)TBST－5%脫脂奶粉稀釋的抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1h，TBST漂洗3次，加入ECL顯色液顯影，Bio－Rad蛋白分析儀掃描；此外，為進(jìn)一步分析純化抗原在血清學(xué)反應(yīng)特異性，蛋白電泳和印跡轉(zhuǎn)移后，與經(jīng)TBST－5%脫脂奶粉稀的血漿（1∶1 000）室溫孵育1h；加入 TBST－5%脫脂奶粉稀釋的 HRP－抗人IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，加入ECL顯色液顯影，Bio－Rad蛋白分析儀掃描顯色結(jié)果。

1．3．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)分析均采用Prism 5／Graphpad軟件。ELISA結(jié)果分析時(shí)陽性Cut－off值取健康對(duì)照組均值加兩個(gè)SD。兩組數(shù)據(jù)比較均運(yùn)用Mann Whitney檢驗(yàn)，取P＜0．05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 結(jié)核分枝桿菌抗原HSP65和38kD的表達(dá)純化 抗原HSP65和38kD經(jīng)大腸桿菌原核表達(dá)純化后，15%的SPS－PAGE膠電泳后以考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)抗原的純度和分子量。HSP65分子量大小為56．7kD，38kD大小為38．2kD，結(jié)果顯示（圖1A）兩個(gè)抗原均與預(yù)測(cè)蛋白分子量相同；同時(shí)兩種純化蛋白的純度均達(dá)90%以上。經(jīng)BCA法測(cè)定 HSP65、38kD濃度分別為0．26mg／ml、0．2mg／ml，用于下一步的血清學(xué)分析。Western Blot結(jié)果顯示（圖1B）兩個(gè)抗原均為經(jīng) His－Tag標(biāo)記的HSP65和38kD。

2．2 活動(dòng)期結(jié)核病患者外周抗HSP65IgG和IgM水平分析 我們采用間接ELISA方法，以抗38kD的IgG為對(duì)照，分析了活動(dòng)期結(jié)核病患者外周抗HSP65IgG的水平，結(jié)果顯示患者外周針對(duì)兩種抗原的IgG的水平均顯著高于健康對(duì)照組（圖2A）。對(duì)于HSP65，當(dāng)我們以O(shè)D450nm＝0．5為反應(yīng)陽性閾值時(shí)，所有活動(dòng)期結(jié)核病患者以及6個(gè)健康人的IgG抗體均為陽性，其中56%的活動(dòng)期結(jié)核病患者的IgG反應(yīng)OD值大于2．0，表明抗 HSP65的IgG抗體在活動(dòng)期結(jié)核病人的靈敏度相當(dāng)高，當(dāng)閾值為0．5時(shí)可達(dá)100%。對(duì)于38kD抗原，活動(dòng)期結(jié)核病患者的IgG水平差異大，且IgG水平低反應(yīng)（OD450nm＜0．5）的患者比例達(dá)26%。此外我們還檢測(cè)了抗HSP65和38kD的IgG1和IgG2抗體水平，結(jié)果表明活動(dòng)期結(jié)核病患者針對(duì)兩種抗原的IgG1水平顯著也高于健康對(duì)照組，而IgG2則未能檢測(cè)到（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖1 結(jié)核分枝桿菌抗原HSP65和38kD的表達(dá)和純化

IgM是感染早期產(chǎn)生的抗體，對(duì)感染的早期診斷具有重要意義，因此我們?cè)跈z測(cè)外周血漿抗HSP65IgG的同時(shí)，也檢測(cè)了其特異性IgM的水平。結(jié)果顯示（圖2B）兩種抗原抗IgM的水平均反應(yīng)較低，并且患者外周血漿特異性IgM的水平低于健康對(duì)照組，其中抗HSP65IgM的水平降低具有顯著差異；而抗38kD IgM的抗體水平在兩組間沒有顯著性差異。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述ELISA分析中針對(duì)兩種抗原的IgG反應(yīng)的特異性，我們挑選了血清學(xué)反應(yīng)為陽性的結(jié)核病人血漿和陰性的健康人血漿各一份進(jìn)行蛋白印跡方法驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖2C），ELISA檢測(cè)中反應(yīng)陽性的病人血漿在蛋白印跡中能夠特異性地與HSP65和38kD反應(yīng)，而ELISA反應(yīng)為陰性的健康人血漿則未能與兩種抗原進(jìn)行應(yīng)答，由此表明我們所建立的ELISA分析方法的特異性和可靠性。

2．3 抗HSP65IgG抗體在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的意義 ROC（Receiver Operating Characteristics）是分析生物標(biāo)志物在疾病診斷中運(yùn)用價(jià)值的重要方法；ROC曲線的 AUC（Area Under Curve）值越大，表明生物標(biāo)志物的診斷意義越大。通過ROC分析活動(dòng)期結(jié)核病患者和健康對(duì)照組IgG抗體反應(yīng)的OD值（圖4），我們發(fā)現(xiàn)HSP65和38kD的ROC曲線的AUC值分別為0．978和0．982。因此，與38 kD一樣，抗HSP65IgG抗體對(duì)結(jié)核病的診斷具有良好的應(yīng)用前景。

圖2 活動(dòng)期結(jié)核病患者外周抗HSP65IgG和IgM抗體水平及其特異性分析

另外，我們還分析了抗HSP65和38kD的IgG抗體在結(jié)核病診斷中的靈敏度和特異性（表2）。當(dāng)閾值設(shè)為健康對(duì)照組的均值加兩個(gè)SD時(shí)，抗HSP65IgG的靈敏度和特異性均為90%（OD閾值為1．04）；抗38kD IgG的靈敏度和特異性分別為88%和90%（OD閾值為0．33）；HSP65與38kD聯(lián)合診斷的靈敏度升高至96%，特異性為80%。當(dāng)閾值為0．5時(shí)，抗 HSP65的IgG抗體的靈敏度達(dá)100%，特異性為80%；而抗38kD IgG的特異性達(dá)100%，靈敏度為76%，HSP65與38kD聯(lián)合診斷的靈敏度和特異性與HSP65單獨(dú)診斷時(shí)一樣，分別為100%和80%。因此，上述結(jié)果顯示抗HSP65IgG在診斷中具有和38kD相當(dāng)?shù)撵`敏度，在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖3 抗HSP65和抗38kD IgG抗體在結(jié)核病診斷中的ROC曲線分析

表2 抗HSP65和38kD IgG的檢測(cè)靈敏度和特異性比較

2．4 抗HSP65IgG水平與結(jié)核病患者臨床病理特征的相關(guān)性 通過收集結(jié)核病患者臨床資料，我們比較分析了抗HSP65和抗38kD IgG抗體水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性，包括年齡、發(fā)病時(shí)間、治療時(shí)間、抗酸染色、痰菌培養(yǎng)以及PPD反應(yīng)性等。結(jié)果顯示，抗HSP65和抗38kD IgG在空洞病變結(jié)核病患者中的平均水平均高于無空洞患者，其中抗HSP65IgG的水平差異具有顯著性；而抗38kD IgG則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。由于患者出現(xiàn)空洞往往和疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，上述結(jié)果提示抗HSP65的IgG抗體水平與結(jié)核病的嚴(yán)重程度存在一定的正相關(guān)性。

圖4 活動(dòng)期結(jié)核病患者中空洞陽性患者與陰性患者之間抗HSP65IgG抗體水平的比較

2．5 抗HSP65IgG抗體在結(jié)核病血清學(xué)診斷中對(duì)抗38kD IgG的補(bǔ)充性 在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了抗HSP65IgG是否對(duì)現(xiàn)有結(jié)核診斷標(biāo)志物具有補(bǔ)充作用，為此，通過綜合分析同一患者中抗HSP65和38kD IgG水平，我們發(fā)現(xiàn)（圖5），6個(gè)38kD IgG抗體陰性的結(jié)核病患者中，4個(gè)為抗HSP65IgG陽性；相反，5個(gè)抗HSP65IgG水平陰性的活性結(jié)核病患者中有3個(gè)是38kD IgG抗體陽性的，如表2結(jié)果所示，HSP65與38kD組合后（閾值為至少一個(gè)為陽性）能進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，本研究所測(cè)定的抗HSP65IgG可以作為目前商業(yè)化應(yīng)用的針對(duì)38kD的抗體應(yīng)答水平檢測(cè)的補(bǔ)充，從而進(jìn)一步提高診斷的靈敏度。

圖5 抗HSP65與抗38kD IgG水平在結(jié)核病患者中的相關(guān)性

3 討論

盡管近年來結(jié)核病的防控取得了一定的效果，但由于艾滋病的蔓延及耐多藥結(jié)核病例的增長(zhǎng)，在發(fā)展中國(guó)家，尤其是非洲和亞洲國(guó)家，結(jié)核病帶來的公共衛(wèi)生壓力依然巨大［1］。因此我們?nèi)孕枰诮Y(jié)核病的診斷、治療和疫苗開發(fā)等方面做深入的研究。尤其在診斷方面，縮短時(shí)間和提高準(zhǔn)確率（包括結(jié)核病的類型）能為結(jié)核病的早期治療以及治療方式提供依據(jù)，從而及時(shí)防止疾病的進(jìn)一步擴(kuò)散。相對(duì)于傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷技術(shù)，近年來出現(xiàn)的關(guān)于結(jié)核病診斷的新技術(shù)，比如基于PCR原理的Xpert－MTB／RIF能快速診斷耐多藥結(jié)核病，但是該方法無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌的死活；基于特異性抗結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞免疫應(yīng)答的T－SPOT和Quanti－FERON方法（干擾素釋放實(shí)驗(yàn)）是目前公認(rèn)的較為準(zhǔn)確和特異性的診斷手段，但是該方法價(jià)格高，操作具有一定的技術(shù)要求，同時(shí)不易區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核。所以，尋找更多的可用于臨床診斷的新技術(shù)和新方法還是當(dāng)前結(jié)核病研究中的重要內(nèi)容。

血清學(xué)診斷具有簡(jiǎn)單、快速、高通量等優(yōu)勢(shì)，但其前提是要尋找獲得特異性的血清生物標(biāo)志物。血清學(xué)生物標(biāo)志物根據(jù)其來源可以分為病原菌來源或是宿主來源，前者主要指來源于病原菌的抗原成分，如乙肝病毒感染后的HBsAg抗原；而宿主來源的血清生物標(biāo)志物則是宿主在抗病原菌免疫應(yīng)答中所產(chǎn)生的標(biāo)志物。在結(jié)核病中，人體感染M．tb后，宿主免疫系統(tǒng)與M．tb的相互作用必然會(huì)產(chǎn)生特異的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答產(chǎn)物，如細(xì)胞因子、抗體等，其中有些分子就可能成為結(jié)核病的重要診斷指標(biāo)，目前廣泛應(yīng)用的基于M．tb特異性抗原刺激引起的IFN－γ釋放試驗(yàn)，如T－SPOT．TB等方法即是成功例子；但由于個(gè)體間差異以及M．tb病原菌的多樣性等，這些試驗(yàn)在實(shí)際應(yīng)用中存在靈敏度不夠高、無法區(qū)分活動(dòng)期與潛伏期感染等缺陷，因此尋找新的結(jié)核病免疫學(xué)標(biāo)志物的研究仍然是全世界結(jié)核病研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)，一些新的免疫應(yīng)答分子正在被關(guān)注，如Novel NC等研究發(fā)現(xiàn)人的全血在體外經(jīng)M．tb抗原Rv0081刺激后產(chǎn)生的IL－12（p40），IL－10和TNF－a在活動(dòng)期結(jié)核病的診斷中靈敏度和特異性均為100%［19］，Ji Young Hong等用 M．tb特異性抗原ESAT－6、CFP－10和 TB7．7刺激人的全血后檢測(cè)上清中趨化因子IP－10的含量，發(fā)現(xiàn)IP－10能作為候選標(biāo)志物用于活動(dòng)期結(jié)核病的診斷，并且在活動(dòng)期結(jié)核病患者血清中的IP－10含量比潛伏期感染者的高，因此血清IP－10能作為其他標(biāo)志物的輔助用于結(jié)核病的診斷［20］；此外，血清IDO活性高低和肺結(jié)核的預(yù)后密切相關(guān)［23］；外周mi－29a也與活動(dòng)期結(jié)核病相關(guān)［24］。

基于體液免疫應(yīng)答的病原菌特異性抗原／抗體的血清學(xué)檢測(cè)在臨床疾病中得到廣泛應(yīng)用，目前常用的商業(yè)化的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑盒及所用抗原有Pathozyme TB complex plus（38kD和16kD），Pathozyme Myco （38kD、LAM），MycoDot（LAM），Anda－TB （A60），TB glycolipid Assay （6種M．tb細(xì)胞壁糖脂）等，這些試劑盒的平均靈敏度一般都在80%以下，但特異性基本都在90%以上［2］；同時(shí)還可以檢測(cè)血清或其他體液（尿液、胸水等）中相關(guān) M．tb抗原，如 LAM、ESAT－6、Ag85復(fù)合物等；其中對(duì)LAM的研究最為詳細(xì)，HIV陽性的結(jié)核病患者尿液中LAM檢出率為47%，但HIV陰性患者則只有14%［22］。雖然全球至少有73家生產(chǎn)商生產(chǎn)和銷售不同的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑盒，但這些試劑盒中的診斷效果還有待于進(jìn)一步提高［21］。

本研究發(fā)現(xiàn)的抗HSP65IgG有可能成為新的活動(dòng)期結(jié)核病血清學(xué)候選標(biāo)志物。HSP65屬于HSP60家族，該家族在原核和真核生物中高度保守，能輔助正?；蛘邞?yīng)激條件下機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)分子的正確折疊［9］。在原核生物中，HSP60又稱為GRoEL，一般細(xì)菌基因組只含有一個(gè)GRoEL基因，而分枝桿菌屬含有GRoEL1和GRoEL2兩個(gè)基因，后者即為HSP65［10］。在應(yīng)激條件下，結(jié)核分枝桿菌可大量表達(dá)保守性抗原，并分布于胞內(nèi)、莢膜，以及分泌至胞外。在機(jī)體抗M．tb免疫中，HSP65扮演著重要角色：分布在 M．tb莢膜層的HSP65分子能促進(jìn)M．tb與巨噬細(xì)胞的相互作用［11］；促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對(duì)病原菌抗原的交叉遞呈［12］。HSP65還能誘導(dǎo)很強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答，M．tb免疫過的小鼠體內(nèi)存在的M．tb特異性T細(xì)胞中20%是HSP65特異性的［13］；而40%的麻風(fēng)病人體內(nèi)存在大量的抗HSP65抗體［14］。有報(bào)道在結(jié)核病患者的胸水［6］和結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液中［7］都檢測(cè)到了抗原HSP65。但至今還沒有研究報(bào)道過抗HSP65的抗體在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的作用。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%的活動(dòng)期結(jié)核病患者血漿中都能檢測(cè)到抗HSP65IgG抗體，而且空洞陽性患者的抗HSP65IgG抗體明顯高于空洞陰性患者，提示該抗體與患者體內(nèi)的細(xì)菌載量或病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

血清學(xué)診斷在細(xì)菌性感染疾病中應(yīng)用則受到很大的限制，這可能是因?yàn)楹筒《緛碓吹目乖N族特異性相比，細(xì)菌性抗原與其他細(xì)菌甚至宿主蛋白存在結(jié)構(gòu)同源性。本研究中的分枝桿菌抗原HSP65與人HSP60蛋白的氨基酸序列存在47%同源性，因此人體感染M．tb后可能會(huì)引起針對(duì)自身抗原HSP60的免疫反應(yīng)。HSP65反應(yīng)性T細(xì)胞與自身抗原HSP60的交叉反應(yīng)可能是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制之一［15－17］。但競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)表明人血清中的抗HSP65的IgG抗體不與HSP60交叉反應(yīng)，反過來抗HSP60的IgG抗體也不與HSP65反應(yīng)［18］。因此，HSP65可以作為候選抗原用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷應(yīng)用。

綜上所述，本研究通過間接ELISA方法比較分析活動(dòng)期結(jié)核病人外周抗HSP65IgG和IgM的水平，結(jié)果顯示HSP65作為一種重要的結(jié)核分枝桿菌病原菌抗原，其所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在結(jié)核病血清學(xué)診斷中具有應(yīng)用潛力，上述研究也為開發(fā)新的多抗原聯(lián)合的血清學(xué)診斷試劑盒提供了新的候選靶抗原。

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