宗方偉，郝筱詩(shī)，郝繼龍

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長(zhǎng)春130033）

臨床上，角膜炎癥是導(dǎo)致視力喪失的主要致盲原因。其致病機(jī)理復(fù)雜，感染性和免疫性因素相互交織，外在毒力和機(jī)體固有免疫反應(yīng)互相影響；其誘發(fā)原因多樣，細(xì)菌、真菌、病毒以及其代謝產(chǎn)物等。角膜炎癥的動(dòng)物模型對(duì)于研究其復(fù)雜的致病機(jī)理至關(guān)重要，是臨床和科研上不可或缺的研究工具。一直以來(lái)，角膜基質(zhì)炎的動(dòng)物模型最普遍的建立方法為基質(zhì)內(nèi)注射，或者是菌液，或者是提純的致病因子，例如內(nèi)毒素脂多糖。此方法沿用以久，最早可追溯到1986年，很多炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)理因此被發(fā)現(xiàn)［1，2］。然而，此種方法有一種主要的缺陷，即是其炎癥反應(yīng)不夠嚴(yán)重和持久。其原因一方面是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如兔子等草食性哺乳動(dòng)物由于其自然生活的習(xí)性，具有較強(qiáng)的創(chuàng)傷愈合能力。此外還有一個(gè)主要原因是注射的水溶液由于角膜內(nèi)皮泵的作用很快的被代謝掉，不能長(zhǎng)久的存留，其作用效果自然也不能持久［2－7］。因此，對(duì)于科研人員而言，很難用這種動(dòng)物模型系統(tǒng)長(zhǎng)久的進(jìn)行機(jī)理性等觀察研究，例如在評(píng)價(jià)某些藥物的藥效及副作用時(shí)?？陀^上，需要一種能夠更為嚴(yán)重且持久的角膜炎癥動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種含有脂多糖的溫控凝膠，能夠原位存在，緩釋、持久的誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。此凝膠具有溫度敏感性，在低溫時(shí)候是液態(tài)，當(dāng)溫度升高，能夠迅速轉(zhuǎn)化為高粘滯性的凝膠。因此，可以以水溶液的形式很輕易的注射進(jìn)角膜基質(zhì)內(nèi)，注射后又能夠成為凝膠長(zhǎng)久存在。我們期待利用此種方法能夠建立起令人滿意的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模過程

本實(shí)驗(yàn)采用新西蘭成年雄性白兔，體重2－2．5千克（北京大學(xué)動(dòng)物中心提供）。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物使用及處理符合視覺與眼科研究協(xié)會(huì)（ARVO）動(dòng)物保護(hù)倫理規(guī)范。利用氯丙嗪與異丙嗪（1∶1，200μl／kg）肌肉內(nèi)注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［4，6］，麻醉后平置于拓普康眼科手術(shù)顯微鏡下?？紤]到動(dòng)物倫理因素，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅使用其右眼。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的10只兔子隨機(jī)均分為兩組，用29G的微量注射器從角膜的周邊穿至中央，基質(zhì)內(nèi)注射LPS溫控凝膠或傳統(tǒng)的水溶液10μl，以角膜輕度隆起及注射區(qū)基質(zhì)變白為注射成功標(biāo)志［2，7］。造模24小時(shí)后，開始實(shí)驗(yàn)觀察，并對(duì)角膜大體相及HE染色計(jì)數(shù)評(píng)分。

1．2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

盡管泊洛沙姆的生物相容性及安全性已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，但為了證明其本身不會(huì)對(duì)角膜的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們首先設(shè)計(jì)了不含LPS的單純18%泊洛沙姆凝膠進(jìn)行基質(zhì)內(nèi)注射，觀察14天。

預(yù)實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過連續(xù)14天的觀察，注射泊洛沙姆空白凝膠后的角膜一直維持透明，無(wú)任何炎癥反應(yīng)。證明泊洛沙姆凝膠本身有很好的生物相容性，不會(huì)引起或?qū)悄さ难装Y反應(yīng)產(chǎn)生影響，亦即不會(huì)對(duì)脂多糖的作用產(chǎn)生影響。

1．3 角膜大體相的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及臨床觀察

造模后的1、3、7、14天，兩組動(dòng)物模型在眼科手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行角膜炎癥浸潤(rùn)及新生血管情況的照相及評(píng)分。其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：

【角膜炎性浸潤(rùn)】

0分 — 完全透明無(wú)混濁

1分—輕度混濁

2分 — 中度混濁，仍可透見虹膜紋理

3分 — 重度混濁，不能看清虹膜紋理，但仍可見虹膜

4分 — 極重度混濁，不能透見虹膜

【新生血管評(píng)分】

0分 — 角膜緣無(wú)新生血管

1分 — 小于1／4象限角膜緣出現(xiàn)新生血管，輕度充盈

2分 —1／4至1／2象限角膜緣出現(xiàn)新生血管，輕度充盈，或小于1／4象限角膜緣出現(xiàn)新生血管，但重度充盈

3分 —1／2至3／4象限出現(xiàn)新生血管，輕度充盈，或1／4至1／2象限角膜緣出現(xiàn)新生血管，但重度充盈

4分 — 全角膜緣出現(xiàn)輕度充盈新生血管，或大于3／4象限角膜緣新生血管重度充盈

5分—一至三個(gè)象限的角膜緣新生血管蔓延至角膜中央?yún)^(qū)，嚴(yán)重充血怒張

6分 — 接近全周邊的新生血管長(zhǎng)入角膜中央，嚴(yán)重充盈充血

1．4 HE染色及炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物模型在角膜大體相照相后過量麻醉致死，迅速取下眼球，常規(guī)方法固定，取下角膜做冰凍切片，包埋于OCT中。切割7μm厚的角膜冰凍切片，半小時(shí)風(fēng)干，室溫下丙酮固定30分鐘，PBS沖洗后，常規(guī)方法行HE染色。病灶區(qū)域內(nèi)炎癥細(xì)胞在400倍的顯微鏡視野下行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的資料數(shù)據(jù)按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 角膜炎性浸潤(rùn)及新生血管

對(duì)比于傳統(tǒng)方法的LPS水溶液，LPS溫控凝膠顯示出明顯的持久、緩釋的特性。連續(xù)14天的觀察結(jié)果下，其建立了更加嚴(yán)重、持久的角膜基質(zhì)炎癥動(dòng)物模型。

造模1天后，兩組間動(dòng)物模型的炎癥對(duì)比無(wú)明顯差別，甚至，某些傳統(tǒng)LPS水溶液組的角膜炎癥反應(yīng)甚至要輕度重于LPS凝膠組，這可能是因?yàn)長(zhǎng)PS在水溶液中彌散較快，在角膜基質(zhì)中更早的誘發(fā)炎癥反應(yīng)。盡管如此，在此后的3、7、14天的觀察中，LPS溫控凝膠組的炎癥反應(yīng)均明顯嚴(yán)重于對(duì)照組。在造模3天后，對(duì)照組的角膜炎癥雖然也較前有所加重，但LPS凝膠組的炎癥反應(yīng)加重更為明顯，相當(dāng)部分的角膜出現(xiàn)了環(huán)行的灰白色浸潤(rùn)，初起時(shí)僅是以弧形出現(xiàn)，后逐漸彌漫至環(huán)形，并開始自旁中央向角膜中央遷延。在造模7天后，對(duì)照組的角膜炎性浸潤(rùn)大部分已消失，僅在角膜緣周邊殘留不同程度擴(kuò)張的新生血管，且此新生血管均未延伸至中央。而在LPS凝膠組，角膜的炎性浸潤(rùn)仍持續(xù)性加重，逐漸變成瓷白色混濁，不能透見虹膜。在3天時(shí)出現(xiàn)的弧形浸潤(rùn)繼續(xù)加重，互相融合，并開始延伸至中央。相應(yīng)的，其新生血管的差異也十分明顯。實(shí)驗(yàn)組的新生血管粗大、充盈，隨著炎癥的進(jìn)展自周邊遷延至中央。造模14天后，由于藥效的時(shí)限性和哺乳動(dòng)物（兔子）對(duì)創(chuàng)傷的愈合反應(yīng)逐步恢復(fù)，兩組動(dòng)物模型的角膜炎性浸潤(rùn)均已明顯減輕。所不同的是，對(duì)照組的角膜幾乎已完全恢復(fù)透明，而實(shí)驗(yàn)組仍可見到輕度的混濁。盡管如此，在角膜殘存的新生血管上，仍可明顯看出兩者的不同。對(duì)照組的新生血管較少，僅限于角膜緣，且枝干都較細(xì)小，幾乎無(wú)充盈；而實(shí)驗(yàn)組的新生血管粗大、充血，互相融合，大面積的向中央?yún)^(qū)延伸。

表1 角膜炎性浸潤(rùn)的評(píng)分 （均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝5）

表2 角膜新生血管的評(píng)分（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝5）

2．2 HE染色炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

角膜基質(zhì)的炎性細(xì)胞數(shù)量反應(yīng)了角膜炎癥的嚴(yán)重程度。在不同時(shí)間點(diǎn)的角膜組織切片炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，基本上和上述宏觀的大體相結(jié)果相對(duì)應(yīng)。在造模1天后，兩組角膜切片中的炎性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0．05），僅有少量炎性細(xì)胞出現(xiàn)，大部分是粒細(xì)胞。而在此后的3、7、14天時(shí)間點(diǎn)上，兩組的結(jié)果便出現(xiàn)了顯著的差異。LPS凝膠組的炎性細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于對(duì)照組（P＜0．01）。在造模14天后，對(duì)照組的角膜切片中，炎性細(xì)胞數(shù)已基本上回降至正常水平，而實(shí)驗(yàn)組仍有大量炎性細(xì)胞存在，盡管跟第7天時(shí)對(duì)比已經(jīng)明顯下降。此結(jié)果顯示角膜大體相炎癥程度和新生血管評(píng)分的差異性，代表了兩組動(dòng)物模型在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)程度上的差異。

表3 角膜切片HE染色炎性細(xì)胞計(jì)數(shù) （均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝5）

3 討論

角膜的炎性浸潤(rùn)是導(dǎo)致視力障礙的最為重要原因之一，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，角膜盲僅次于白內(nèi)障，位居致盲疾病的第二位。在角膜炎的病理進(jìn)程中，角膜基質(zhì)層的炎性反應(yīng)是最為重要的一方面。感染性因素和機(jī)體的免疫相關(guān)因素相互影響，導(dǎo)致炎癥的不斷進(jìn)展、惡化，例如角膜基質(zhì)內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶類在炎癥進(jìn)程中的激活導(dǎo)致了基質(zhì)纖維不斷溶解，排列紊亂，其結(jié)果是角膜失去了原來(lái)的透明性，視力嚴(yán)重喪失。細(xì)菌的內(nèi)毒素脂多糖已被證明是主要的毒力因子，在既往的多次實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)［1，3，8－10］。也因此，借助于 LPS誘導(dǎo)角膜的炎癥反應(yīng)成為科研上常用的方法之一。

3．1 內(nèi)毒素的基質(zhì)內(nèi)注射

目前為止，有很多種方法建立角膜炎癥的動(dòng)物模型，例如深層縱向的切割、角膜上皮的刮除、角膜縫線法以及基質(zhì)內(nèi)注射等。眾多方法中，基質(zhì)內(nèi)注射的方法最為常用，因?yàn)槠淇勺钚〕潭壬显斐深~外創(chuàng)傷，保持上皮細(xì)胞的完整性，對(duì)于研究單純的角膜基質(zhì)層的反應(yīng)機(jī)理較為重要（額外干擾因素最少）。角膜基質(zhì)層的改變被證實(shí)是外來(lái)的感染性毒力因素和自身免疫反應(yīng)的結(jié)果。盡管如此，此方法造成的基質(zhì)炎動(dòng)物模型不夠嚴(yán)重和持久，注射的水溶液被內(nèi)皮泵迅速代謝，難以長(zhǎng)久發(fā)揮作用，給科研和臨床上的研究帶來(lái)了困難。

3．2 泊洛沙姆溫控凝膠

泊洛沙姆作為一種惰性的高分子材料，其生物相容性非常好，作為助溶的佐劑已經(jīng)在某些學(xué)科上應(yīng)用于臨床，用于肌肉、血管內(nèi)注射，某些藥物的緩釋劑型。在眼科領(lǐng)域，已有些研究人員嘗試將其配制進(jìn)滴眼液，用以加強(qiáng)其粘附性［11－13］。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用其溫度敏感性的特性，制作成LPS凝膠進(jìn)行角膜基質(zhì)內(nèi)注射，使原本不易存留的脂多糖得以持久、緩釋的作用，取得了令人滿意的效果。

3．3 角膜的炎性浸潤(rùn)環(huán)

本實(shí)驗(yàn)的LPS凝膠組中，很多動(dòng)物模型出現(xiàn)了角膜的炎性浸潤(rùn)環(huán)。最初是較小的、不完整的弧形浸潤(rùn)，隨著炎癥進(jìn)展逐漸發(fā)展成環(huán)形，且自周邊開始向角膜中央蔓延，最終導(dǎo)致了角膜的大片瓷白色混濁。相應(yīng)的，新生血管也隨之長(zhǎng)入中央。此動(dòng)態(tài)過程清晰可見，反復(fù)出現(xiàn)于凝膠組的多例動(dòng)物模型中，具有一定的代表性，而從未出現(xiàn)于傳統(tǒng)的LPS水溶液組中。在之后的角膜切片染色中，發(fā)現(xiàn)此環(huán)形的浸潤(rùn)主要為中性粒細(xì)胞。我們推測(cè)此浸潤(rùn)環(huán)的出現(xiàn)是由于中央?yún)^(qū)注射的LPS不斷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的結(jié)果。中央?yún)^(qū)刺激原的持續(xù)存在，激活了角膜基質(zhì)層內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路等介質(zhì)的釋放（如NF－KB途徑等），持續(xù)性的吸引中性粒細(xì)胞移行，自周邊向刺激源聚集，由弧形的浸潤(rùn)灶融合成環(huán)形，自周邊蔓延至中央。借助于改良的LPS凝膠，我們可以清晰的、動(dòng)態(tài)的看到這一全過程。

總而言之，本實(shí)驗(yàn)借助于創(chuàng)新性的LPS溫控凝膠，對(duì)傳統(tǒng)的脂多糖水溶液基質(zhì)內(nèi)注射方法進(jìn)行了改良，建立起了更為嚴(yán)重且持久的動(dòng)物模型，取得了較為滿意的效果，為今后的科研工作提供了一定的方便。

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