陳 雨，鄭少雄，孟春梅，郝 杰

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院 內分泌科，天津300211）

T2DM的病因可歸結為胰島β細胞分泌胰島素缺陷和胰島素作用障礙。炎癥或免疫因素是胰島素抵抗和β細胞功能衰竭的重要原因，大量的免疫炎癥介質參與了上述過程，其中，關于IL－6的作用一直是一個引起爭議的話題。本研究旨在探討炎癥因子IL－6在T2DM發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 健康雄性SD大鼠36只，平均體重254±7．5g，購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1．1．2 主要試劑 高糖高脂乳劑（脂肪乳）；鏈脲佐菌素 （STZ）；IL－6 抗 原、抗 體；Trizol試 劑、Oligo（dT）18、dNTP、目的基因引物 DNA、內參基因引物DNA、逆轉錄酶。

1．2 方法

1．2．1 T2DM 大鼠模型的建立，IL－6抗原、抗體的干預及標本留取 按體重隨機分為4組：N組（正常對照組，10只），A 組（糖尿病IL－6抗原組，10只），B組（糖尿病IL－6抗體組，8只），C（糖尿病對照組，8只）。均普通飼料喂養(yǎng)。A、B、C三組連續(xù)7周按1ml／100mg體重／d給予脂肪乳灌胃，N組按同樣劑量給予水灌胃對照，之后稱取動物體重，按30mg／kg體重尾靜脈注射STZ。3天后，血糖測定結果大于16．7mmol／L為T2DM造模成功。造模后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)和脂肪乳灌胃（0．5ml／100mg體重／d）。成模后第2天，A組給予IL－6抗原稀釋液（10 μg／ml）腹腔注射0．6ml／只／d，連續(xù)干預5天；B組給予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，連續(xù)干預4天，第5天IL－6抗體液（1mg／ml）腹腔注射0．6ml／只；C、N組均給予0．01MPBS液腹腔注射0．6ml／只／d，連續(xù)干預5天。四組大鼠均于成模后第7天處死。采集標本：剪尾測血糖，股動脈取血，稱重，并取肝臟液氮保存。

1．2．2 血糖及胰島素測定 羅氏血糖儀每周檢測血糖1次；血清胰島素采用液相平衡競爭放射免疫分析法測定。

1．2．3 按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清IL－6；提取大鼠肝細胞膜，按照試劑盒說明，采用固相夾心ELISA法測定肝組織細胞膜上胰島素受體（InsR）。

1．2．4 肝臟組IL－6mRNA表達 Trizol提取肝臟細胞總RNA，后經逆轉錄反應，合成cDNA，對其進行PCR擴增。采用的引物序列及反應參數如下：IL－6，上游：5’－AACTCCATCTGCCCTTCA－3’，下游引物：5’－GGTCCTTAGCCACTCCTT－3’。反應參數為94℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸10min，擴增片段長度588bp；內 參 基 因 β－actin，上 游：5’－CACCCGCGAGTACAACCTTC－3’，下游：5’－CCCATACCCACCATCACACC－3’，反 應 參 數 為 94℃ 5 min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸10min，擴增片段長度232bp。用SYNGENE全自動凝膠成像分析系統(tǒng)對IL－6和內參β－actin的RT－PCR產物各條帶灰度進行圖像采集，計算IL－6／β－actin的比值，進行半定量分析。

1．3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11．5軟件包處理行統(tǒng)計分析，數據用ˉx±s表示，組間比較采用方差分析；采用Pearson相關系數評價IL－6抗原、抗體與血糖、胰島素等指標的相關性。

2 結果

2．1 一般情況 普通飲食飼養(yǎng)并輔以脂肪乳灌胃，7周后與對照組相比，糖尿病A、B、C組血清胰島素升高明顯（20．10±10．02，20．45±7．94，19．46±5．94vs11．57±5．85）（P＜0．05），7周時，各組大鼠體重的比較均無統(tǒng)計學差異。實驗結束時，糖尿病A、B、C組體重較對照組降低明顯（309．90±20．75，303．75±39．26，319．75±20．53vs410．60±22．37）（P＜0．05）；糖尿病A、B、C組血糖較對照組仍升高明顯（24．03±6．93，23．80±1．67，21．93±1．56 vs5．50±0．42）（P＜0．05）。

2．2 肝細胞膜InsR、血清IL－6的變化 與N組比較，A、B、C組大鼠肝細胞膜胰島素受體水平升高（7．09±4．93，7．03±4．97，6．84±4．65vs4．39±3．09）（P＜0．05）；與B、C、N組比較，A組大鼠血清IL－6水平明顯升高（1058．89±223．97vs404．34±60．33，411．72±126．17，407．43±88．52）（P＜0．05）。

2．3 IL－6抗原抗體干預前后對胰島素相關指標的影響

2．3．1 IL－6抗原及IL－6抗體等干預前后各組的血糖結果比較 見表1。A、B、C三組干預后較干預前血糖下降明顯（P＜0．05），但對各組內干預前后血糖的相關性分析顯示，二者無相關關系（P＞0．05）。表明IL－6抗原、IL－6抗體、PBS的干預對糖尿病大鼠的血糖沒有影響。

表1 干預前后各組組內的血糖變化

2．3．2 IL－6抗原及IL－6抗體等干預前后各組的胰島素結果比較 見表2。B、C二組干預后較干預前胰島素下降明顯（P＜0．05）；而與干預前相比，A組干預后的胰島素水平下降，無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。對各組內干預前后胰島素的相關性分析顯示，僅B組經IL－6抗體干預，前、后胰島素水平有相關性，相關系數r＝0．759（P＜0．05）。表明，IL－6抗體的干預能夠使糖尿病大鼠的胰島素水平降低。2．4 RT－PCR 檢測各實驗組大鼠肝臟組織IL－6 mRNA的結果 外源性給予IL－6抗原干預，使A組大鼠肝臟的IL－6表達增加，僅與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；見表3、圖1。表明外源性給予IL－6抗原、抗體對大鼠肝臟組織的IL－6mRNA表達有影響。

表2 干預前后各組組內的胰島素變化

表3 各組大鼠肝臟組織IL－6mRNA表達

圖1 大鼠肝臟組織IL－6mRNA RT－PCR擴增電泳結果

3 討論

胰島素抵抗和β細胞功能障礙是T2DM發(fā)病的兩大機制。然而胰島素抵抗也可以同樣程度的存在于許多無糖尿病人群中，因此單獨的胰島素抵抗不可能是T2DM的決定性致病因素。更多的事實表明，胰島特別是胰島β細胞的異常可能是T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［1－2］。

近年來，一些臨床流行病學的研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者血循環(huán)中的急性期反應產物和炎癥因子水平升高，存在自然免疫的激活和低度炎癥［3］；而且抗炎治療可以改善T2DM患者糖代謝異常、提高胰島素敏感性。

IL－6產生于多種不同類型的細胞，肝臟的IL－6主要由Kupffer細胞、內皮細胞分泌，并以旁分泌方式作用于肝細胞［4］，它既能刺激肝細胞合成急性期反應蛋白，又能引起再生反應，其作用主要通過IL－6受體活化細胞內一系列信號蛋白分子來實現(xiàn)。目前的研究現(xiàn)狀表明，IL－6是炎癥所導致的代謝綜合征的罪魁禍首。有研究報道，IL－6缺乏的大鼠血糖水平升高并有糖耐量減低，雌性大鼠的血脂升高［5］。Senn等［6］研究發(fā)現(xiàn)，IL－6能抑制胰島素信號轉導及胰島素作用。Rotter等研究發(fā)現(xiàn)，短時間（120分鐘）注射IL－6對大鼠肝臟、肌肉、脂肪的胰島素受體及胰島素受體底物磷酸化無影響［7］。Klover等［8］在對小鼠注射IL－6第5天時發(fā)現(xiàn)，血漿IL－6升高6倍，與肥胖狀態(tài)下IL－6水平相似（升高2－4倍）。另外，小鼠肝臟STAT（signal transducer and activator of transcription，信號轉導子和轉錄激活子）磷酸化增加，胰島素受體磷酸化下降60%，IRS－1和IRS－2磷酸化分別降低60%和40%。IL－6亦使葡萄糖激酶mRNA轉錄降低約40%，糖耐量試驗提示胰島素敏感性降低。Klover等［9］在對Lep ob小鼠注射IL－6中和抗體后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IL－6缺乏的Lep ob小鼠胰島素受體自身磷酸化及蛋白激酶激活分別增加35%及50%，高胰島素正常血糖鉗夾試驗中，內源性葡萄糖生成抑制是對照組的2．8倍。這說明IL－6缺乏的小鼠胰島素敏感性有所改善，反映了IL－6在肝臟IR中的作用。

我們的實驗取T2DM大鼠的肝臟組織，在經過IL－6抗原、抗體等干預后，應用RT－PCR技術測定IL－6mRNA的表達，結果顯示，經IL－6抗原腹腔注射的糖尿病大鼠肝臟IL－6mRNA的表達明顯高于IL－6抗體腹腔注射組，但與糖尿病對照組及正常對照組之間的升高沒有統(tǒng)計學的意義，這表明IL－6抗原及IL－6抗體對于肝臟的炎性細胞因子表達有一定作用，即IL－6抗原可能能夠刺激肝臟的Kupffer細胞、內皮細胞等分泌IL－6，IL－6抗體也可能對抑制肝臟IL－6mRNA的表達起到不可忽視的作用。

同時，血清中的IL－6水平采用ELISA法測定也顯示IL－6抗原干預組較其他組明顯升高，而IL－6抗體腹腔注射的糖尿病大鼠與PBS腹腔干預的糖尿病和正常對照組大鼠之間沒有明顯差別，可以認為IL－6抗體的腹腔注射對于血清中的IL－6表達沒有顯著作用，而IL－6抗原的腹腔注射則會顯著增加血循環(huán)中IL－6的水平，但其具體機制還有待于進一步研究。此外，本實驗顯示IL－6抗體的干預能夠使糖尿病大鼠的胰島素水平降低。

采用ELISA法測定肝細胞膜上InsR，結果顯示糖尿病不同干預組間比較無統(tǒng)計學差別，僅有糖尿病組較正常組升高明顯。其機制可能與T2DM大鼠胰島素在肝臟作用減低，胰島敏感性下降，代償性引起高胰島素血癥和肝臟胰島素受體表達增加有關。

綜上，本實驗證實了慢性低水平炎癥是T2DM的發(fā)生發(fā)展的重要機制，IL－6等炎癥因子或免疫因素促使胰島素抵抗和β細胞功能衰竭。另外，本實驗存在可以改進的的地方，即造模前后脂肪乳灌胃劑量一致，可保證大鼠的持續(xù)高胰島素血癥、胰島素抵抗狀態(tài)、胰島素敏感性降低。因此，從另一角度而言，IL－6缺乏可能對T2DM大鼠胰島β細胞功能具有一定保護作用。慢性低水平炎癥在T2DM病生理過程中的重要地位，為今后T2DM病理機制研究和防治提供相應理論依據。

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