王雅雯，于 宏，王世寶，黃映輝

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 血液腫瘤科，吉林 長春130033）

YWHAZ（又名14－3－3ζ）屬于14－3－3基因家族，分子量約28－33kD。人類基因組中存在7種14－3－3家族基因，分別是α／β、ε、η、γ、τ／θ、δ／ζ和σ，其中α、δ和τ分別是β、ζ和θ的磷酸化形式。14－3－3蛋白表達(dá)于從植物到動物的所有真核細(xì)胞中，且氨基酸序列具有高度同源性，不同種屬的每個亞型序列也基本相同［1］。14－3－3蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)，自然狀態(tài)下以同源二聚體（hormodimer）或異源二聚體（heterodimer）的形式存在，通過特異性識別底物上的磷酸化基序RSXpSXP或RXXXpSXP而與該底物結(jié)合［2］，在信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，肺癌、乳腺癌、頭頸鱗癌、胃癌［4－7］等多種腫瘤細(xì)胞中均有YWHAZ高表達(dá)，且表達(dá)程度與腫瘤惡行性呈一定相關(guān)性［8］。YWHAZ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，已然成為極具研究價值的潛在原癌基因，但其作用機(jī)制鮮有報道。本實驗將構(gòu)建YWHAZ重組腺病毒、YWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒并在293T細(xì)胞中驗證基因表達(dá)情況，為體內(nèi)外進(jìn)一步研究YWHAZ基因及其相關(guān)信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

重組穿梭質(zhì)粒pacAd5CMV－IRES－GFP、腺病毒骨架載體pacAd5 9．2－100（Cell BioLabs公司）；重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PLXSN－IRES－GFP（實驗室現(xiàn)有）；E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞（TIANZHEN BIOTECH 公司）；腺病毒包裝細(xì)胞293T（實驗室現(xiàn)有）；逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Ampho293（實驗室現(xiàn)有）。

1．2 生化試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、calI、BamH和PacⅠ（New England Biolabs公司）；DNA 純化回收試劑盒（Roche公司）；堿性磷酸化酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、T4DNA 連接酶、DL 10，000DNA marker、Trans 2KDNA marker（TaKaRa公司）；100bp DNA marker、質(zhì)粒DNA ?。罅刻崛≡噭┖校˙ioscience 公司）；FuGENE Transfection Reagent（Invitrogen公司）；DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（Invitrogen 公 司 ）；胎 牛 血 清 （Biological Industries）；病毒純化試劑盒（Cell BioLabs公司）；上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成引物合成及重組質(zhì)粒測序。

1．3 pacAd5－YWHAZ重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用 上 游 引 物：5′－CTATCGATTGGATGGATAAAAATGAAGCT－3′和下游引物：5′－GCGGATCCTTAATTTTCCCCTCC－3′，從293T 細(xì)胞中擴(kuò)增YWHAZ基因。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶claI和BamHI雙酶切，純化回收后，經(jīng)T4DNA連接酶連接于 pacAd5CMV－IRES－GFP 的 claI和BamHI多克隆位點，16℃定向連接12h后轉(zhuǎn)化E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。Ampicillin抗性培養(yǎng)基篩選、擴(kuò)增目的菌種。小量提取質(zhì)粒，用claI和Bam－HI雙酶切鑒定。

1．4 PLXSN－YWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用 上 游 引 物：5′－CCGCAATTCATGGATGGATAAAAATGAAGCT－3′和下游引物：5′－CCGGAATTCTTAATTTTCCCCTCC－3′，從 293T 細(xì)胞中擴(kuò)增YWHAZ基因。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI單酶切，再經(jīng)堿性磷酸酶去磷酸化，純化回收后經(jīng)T4DNA連接酶連接于PLXSN－IRESGFP的EcoRI多克隆位點。16℃定向連接12h后轉(zhuǎn)化E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。Ampicillin抗性培養(yǎng)基篩選、擴(kuò)增目的菌種。小量提取質(zhì)粒，用EcoRI單酶切鑒定。

1．5 PacAd5－YWHAZ重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增

PacI單酶切pacAd5－GFP－YWHAZ及pacAd5 9．2－100，去除pacAd5 9．2－100中的ori和 Amp等質(zhì)粒構(gòu)件。用FuGENE Transfection Reagent將酶切后的兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至預(yù)鋪有293T細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿（見圖1A）。24小時后30%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（見圖1B），7天后80%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（見圖1C）且出現(xiàn)完全細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect）。收獲細(xì)胞，－80℃與37℃反復(fù)凍融三次獲得pacAd5－GFP－YWHAZ第一代腺病毒。重復(fù)感染293T細(xì)胞，大量擴(kuò)增病毒。經(jīng)病毒純化試劑盒（ViraBind Adenovirus purification Kit）純 化 后－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 A光鏡下未感染病毒的293T細(xì)胞；B pacAd5－YWHAZ及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時；C pacAd5－YWHAZ及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞7天；D PLXSN－GFP－YWHAZ轉(zhuǎn)染ampho293細(xì)胞并篩選6天。

1．6 PLXSN－GFP－YWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、擴(kuò)增

Ampho293細(xì)胞帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝基因，直接用 FuGENE Transfection Reagent將 PLXSNGFP－YWHAZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至預(yù)鋪有Ampho293細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿，24小時后40%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。G418（500μg／ml）篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，3天后60%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，6天后90%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（見圖1D），收取細(xì)胞上清液，－80℃凍存保存病毒。

1．7 病毒感染效果及基因過表達(dá)檢測 分別用Pac－Ad5－GFP－YWHAZ 重 組 腺 病 毒、PLXSN－GFPYWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染293T細(xì)胞，24、48、72小時后觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況，驗證病毒侵染效果。提取正常293T及病毒感染的293T的mRNA，PCR檢測YWHAZ基因表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重 組 腺 病 毒 質(zhì) 粒 pacAd5－GFP－YWHAZ 經(jīng)claI、BamHI雙酶切，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PLXSNGFP－YWHAZ經(jīng)EcoRI單酶切，瓊脂糖凝膠電泳，均獲得大小約為700bp（YWHAZ）、7kb（載體）片段。質(zhì)粒構(gòu)建正確（見圖2A）。

2．2 重組質(zhì)粒測序及PCR擴(kuò)增鑒定

重組腺病毒質(zhì)粒pacAd5－GFP－YWHAZ、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PLXSN－GFP－YWHAZ進(jìn)行基因測序，測序正確（見圖2B、C）。分別以兩重組質(zhì)粒為模板，YWHAZ特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得359 bp目的基因。證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（見圖2D）。

2．3 病毒感染效果及YWHAZ基因過表達(dá)檢測

分別用 PacAd5－GFP－YWHAZ 重組腺病毒、PLXSN－GFP－YWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染6孔板中293T細(xì)胞，24小時綠色熒光40%、30%；48小時綠色熒光60%、40%；72小時綠色熒光80%、60%（圖3A、B）。提取正常293T細(xì)胞及兩種病毒分別感染的293T細(xì)胞的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后調(diào)整同一模板濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)，病毒感染的293T細(xì)胞與未感染293T細(xì)胞相比，顯著高表達(dá)YWHAZ基因（圖3C），證明兩種YWHAZ病毒均制備成功。

圖2 A重組質(zhì)粒的酶切鑒定：○MDL 10，000DNA marker；①pacAd5－GFP－YWHAZ雙酶切可見700bp目的片段；②PLXSN－GFP－YWHAZ單酶切可見700bp目的片段。B重組腺病毒質(zhì)粒中YWHAZ測序圖。C重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中YWHAZ測序圖。D兩種重組病毒質(zhì)粒為模板，PCR可獲得目的基因：○MTrans 2K DNA marker；①重組腺病毒質(zhì)粒為模板；②重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒為模板。

圖3 A重組腺病毒感染293T細(xì)胞3天；B重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染293T細(xì)胞3天；C病毒感染的293T細(xì)胞顯著高表達(dá)YWHAZ基因：○M100bp DNA marker；①未感染病毒的293T細(xì)胞中擴(kuò)增YWHAZ基因，②③分別為從重組腺病毒及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的293T細(xì)胞中擴(kuò)增YWHAZ基因。

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移系多種基因突變的結(jié)果。原癌基因的發(fā)現(xiàn)為解釋腫瘤發(fā)生、早期診斷腫瘤及腫瘤靶向治療提供了新思路。YWHAZ是最新發(fā)現(xiàn)的一個原癌基因，其在正常組織中少量存在，但在許多腫瘤組織中高表達(dá)［8］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控細(xì)胞周期，明顯增加G2期細(xì)胞比率，增強(qiáng)細(xì)胞增殖，明顯抑制細(xì)胞凋亡［9］。轉(zhuǎn)移性肺癌中該基因表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移性癌，提示YWHAZ與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［10］。高表達(dá)YWHAZ基因的乳腺癌表現(xiàn)出對他莫昔芬強(qiáng)耐藥性［11］，順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞也高表達(dá)YWHAZ基因［12］，說明該基因可能通過某些機(jī)制導(dǎo)致了腫瘤的藥物抵抗［13］。越來越多的實驗結(jié)果表明YWHAZ與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥有關(guān)［14］，但其作用機(jī)制鮮有報道。構(gòu)建載體，達(dá)到過表達(dá)該基因的目的，用以深入研究該基因功能及作用機(jī)制成為亟待解決的問題。本實驗從過表達(dá)病毒的構(gòu)建入手，成功構(gòu)建了可高效表達(dá)目的基因的重組腺病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒，可高效侵染目的細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá)YWHAZ的細(xì)胞系。這一實驗成果是后續(xù)該基因功能性研究的基礎(chǔ)，為深入研究該基因提供了必要的工具。

本實驗采用最新的RAPAd CMV Adenoviral Bicistronic Expression System 構(gòu)建 YWHAZ重組腺病毒。該系統(tǒng)3周即可完成重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增，極大縮短了實驗時間，且包裝出的腺病毒轉(zhuǎn)染效率高、感染細(xì)胞范圍廣、可高效介導(dǎo)基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移［15］。本實驗首次用自帶包裝信息的 Ampho293包裝、擴(kuò)增YWHAZ重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。既避免了共轉(zhuǎn)染包裝質(zhì)粒，簡化了實驗步驟；又篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，持續(xù)產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒可使YWHAZ插入宿主細(xì)胞染色體，使目的細(xì)胞穩(wěn)定的過表達(dá)該基因［16］，為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。兩種過表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建為體內(nèi)外進(jìn)一步研究YWHAZ基因及其相關(guān)信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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