彭潤(rùn)生，陳 昊，楊兆華，王春生

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院 心外科，上海市心血管病研究所，復(fù)旦大學(xué)器官移植中心，上海200032）

目前，同種異體心臟移植已經(jīng)成為治療終末期心臟病的有效手段，但感染與排斥反應(yīng)仍然是影響治療效果的重要因素［1］。在人體器官移植中，巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是一種最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染病原體，其引起的感染不僅可以直接導(dǎo)致受體患者死亡，而且可以加速移植器官的急、慢性排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植器官的功能減退甚至喪失，影響治療效果［2］。本研究利用小鼠腹腔異位心臟移植模型研究巨細(xì)胞病毒感染對(duì)同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 受體BALB／c小鼠，雌性，體重20－25g，10－12w，供體C57BL／6小鼠體重20－25g，8－10w，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1．1．2 小鼠巨細(xì)胞病毒 小鼠巨細(xì)胞病毒Smith株（MCMV Smith）由復(fù)旦大學(xué)病毒研究所惠贈(zèng)，在健康純系BALB／c小鼠唾液腺中傳代擴(kuò)增。鼠胚成纖維細(xì)胞（murine embryofibroblast，MEF）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分院。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 MCMV Smith株小鼠體內(nèi)傳毒 采用健康純系BALB／c小鼠，環(huán)胞素 A（CsA）（20mg／kg）腹腔注射，每日1次，直到2w后處死。第1次CsA注射后第2天，小鼠腹腔接種MCMV Smith病毒懸液104PFU。2w后處死小鼠，取唾液腺，用無(wú)血清Dubecco DEMEagle培養(yǎng)液充分勻漿后，離心，3 000r／min，20min，取上清分裝，－80℃冰箱保存。

1．2．2 MCMV Smith株感染性測(cè)定（蝕斑形成實(shí)驗(yàn)） DMEM培養(yǎng)液加3%新生小牛血清（BAS，浙江三利公司），將病毒稀釋為10－1～10－12PFU；取100μl接種于24孔無(wú)菌培養(yǎng)板內(nèi)已生長(zhǎng)成單層的MEF細(xì)胞上，做3個(gè)復(fù)孔。用含1%瓊脂糖的維持液覆蓋，置5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)4－5d取出，以10%甲醛固定30min，沖洗，除去每孔中的瓊脂凝塊。用0．5%結(jié)晶紫染色5min，置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)各孔空斑數(shù)，計(jì)算所制備的MCMV Smith株的感染性病毒量。PFU／ml＝蝕斑均數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)／病毒接種量（ml）。

1．2．3 小鼠腹腔異位心臟移植模型建立 采用Ono術(shù)式進(jìn)行小鼠腹腔異位心臟移植，即供體小鼠升主動(dòng)脈與受體小鼠腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，供體小鼠肺動(dòng)脈與受體小鼠腹部下腔靜脈端側(cè)吻合。術(shù)后每日經(jīng)腹壁觸摸移植心跳情況，若無(wú)心跳，則表明移植心臟死亡。移植后72h移植心臟停跳或受體死亡，視為手術(shù)失敗。

1．2．4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，每組20只。同質(zhì)移植組（A組）：供受體皆為BALB／c1．2．小鼠。當(dāng)日起，每日腹腔注射與CsA等量的生理鹽水，并于術(shù)后第2d腹腔注射與MCMV等量的生理鹽水0．2ml，術(shù)后10d處死。CsA 組（B組）：BALB／c小鼠為受體，C57BL／6小鼠為供體，術(shù)后當(dāng)日即給予CsA注射液20mg／kg，每日1次，術(shù)后第2日腹腔注射生理鹽水0．2ml；CsA＋MCMV干預(yù)組（C組）：BALB／c小鼠為受體，C57BL／6小鼠為供體，術(shù)后當(dāng)日即腹腔注射CsA注射液20mg／kg，每日1次，術(shù)后第2日腹腔接種104PFU MCMV0．2 ml。

術(shù)后觀察指標(biāo)及標(biāo)本收集 術(shù)后觀察心跳情況，心臟跳動(dòng)停止為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。術(shù)后第10d，各組處死10只，將移植心臟取出，分別做病理組織學(xué)和病毒滴度檢測(cè)。

1．2．5 病理組織學(xué)檢查 移植心臟在10%中性福爾馬林固定24h，脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色。

1．2．6 MCMV病毒滴度測(cè)定 采用蝕斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定移植心肌中和自身心肌MCMV病毒滴度。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 測(cè)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S）表示，采用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA variance analysis），P＜0．05被認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2．1 移植心存活時(shí)間 術(shù)后C組于第5、7日各死亡1只，其余各組均存活。到第10日，移植心臟均存活。但C組移植心臟跳動(dòng)明顯減弱，且心律快慢不齊，A組移植心臟跳動(dòng)有力，規(guī)則，而B(niǎo)組移植心臟跳動(dòng)介于A組和C組之間，節(jié)律尚規(guī)則。移植心臟平均存活時(shí)間，A組長(zhǎng)期存活，B組為16．7±1．9 d，C組為12．4±1．3d。C組移植心的存活時(shí)間較B組顯著縮短（P＜0．01）（表1）。

表1 各組移植心臟存活時(shí)間（d）

2．2 病理組織學(xué)改變 術(shù)后10d，A組移植心臟大小基本正常，無(wú)水腫，色紅質(zhì)軟，搏動(dòng)好，與周?chē)M織無(wú)粘連；心肌間質(zhì)偶見(jiàn)水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，幾無(wú)排斥反應(yīng)；B組移植心臟搏動(dòng)有力，顏色鮮紅，質(zhì)軟，與周?chē)尺B較輕，心臟增大不明顯；鏡下觀察移植心臟心肌間質(zhì)內(nèi)有局灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌有變性；C組移植心臟搏動(dòng)微弱，體積明顯增大，重量增加，腫脹明顯，與周?chē)M織粘連，質(zhì)地變硬，彈性減弱，顏色灰暗，局部呈蒼白色。鏡下見(jiàn)心內(nèi)、外膜下及心肌間質(zhì)有彌漫性淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)；心肌細(xì)胞可發(fā)生變性、壞死。（見(jiàn) 圖1）。

圖1 各組移植心臟病理組織學(xué)改變

2．3 C組移植心肌和自身心肌MCMV病毒滴度測(cè)定結(jié)果 采用蝕斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定移植心肌中和自身心肌MCMV病毒滴度（見(jiàn)表2、3），術(shù)后10d移植心肌的病毒滴度遠(yuǎn)大于自身心肌的病毒滴度（P＜0．01），觀察終點(diǎn)即移植心臟停止跳動(dòng)時(shí)移植心肌的病毒滴度遠(yuǎn)大于自身心肌的病毒滴度（P＜0．01）。

表2 術(shù)后10日移植心肌和自身心肌的病毒滴度

表3 觀察終點(diǎn)移植心肌和自身心肌的病毒滴度

3 討論

CMV是一種常見(jiàn)的皰疹病毒，分布廣泛，我國(guó)是HCMV感染的高發(fā)地區(qū)，兒童血清抗HCMV陽(yáng)性率 為 83．2% －87．3%，成 人 則 達(dá) 95% 以 上［3］。CMV是一種比較常見(jiàn)的條件性感染的病原體，在免疫力正常的個(gè)體，其通常表現(xiàn)為隱性感染，但對(duì)于器官移植及免疫妥協(xié)（如應(yīng)用免疫抑制劑、AIDS等）個(gè)體來(lái)說(shuō)，常導(dǎo)致CMV感染或隱性感染復(fù)發(fā)，并且參與移植器官的急、慢性排斥反應(yīng)，造成移植器官失功甚至受體死亡。

由于CMV具有嚴(yán)格的種屬特異性，難以建立HCMV感染動(dòng)物的模型，鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）和HCMV相似，具有很大同源性，所以研究 MCMV對(duì)移植后的感染和急、慢性排斥反應(yīng)及其相互關(guān)系來(lái)探討HCMV關(guān)于這方面的機(jī)制，對(duì)于臨床具有指導(dǎo)意義。

愈來(lái)愈多的臨床資料及動(dòng)物試驗(yàn)表明，CMV參與器官移植的急性排斥反應(yīng)［1，4］。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證MCMV感染加重小鼠移植心臟的急性排斥反應(yīng)，MCMV感染組小鼠移植心臟存活時(shí)間明顯少于非MCMV感染組，病理學(xué)改變亦支持MCMV感染加重小鼠移植心臟的急性排斥反應(yīng)，非MCMV感染組病理組織學(xué)表現(xiàn)，心肌損害明顯低于MCMV感染鼠。

心臟移植術(shù)后，為防止移植物排斥，需要免疫抑制藥物抑制Th1類(lèi)免疫反應(yīng)，最理想的免疫狀態(tài)是調(diào)節(jié)Th1／Th2類(lèi)反應(yīng)處于一個(gè)新的平衡，使Th1類(lèi)反應(yīng)即不至于過(guò)強(qiáng)而發(fā)生排斥反應(yīng)，也不至于過(guò)弱而招致感染，尤其是機(jī)會(huì)性病原體感染。CMV感染多發(fā)生于心臟移植術(shù)后1年，尤其1－3月［5］，此時(shí)Th1／Th2類(lèi)反應(yīng)沒(méi)有建立一個(gè)新的平衡，免疫系統(tǒng)紊亂，免疫抑制藥物也處于不斷調(diào)整之中，一旦過(guò)量，極易導(dǎo)致CMV感染，感染之后，機(jī)體為了控制、殺滅CMV，重新調(diào)整兩類(lèi)反應(yīng)的平衡。CMV是細(xì)胞內(nèi)感染的病原體，其清除有賴于細(xì)胞免疫，上調(diào)Th1類(lèi)應(yīng)答，通過(guò)上調(diào)IL－2、TNF及IFN－γ等細(xì)胞因子［6］，增強(qiáng) CTL、單核細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性，這不僅僅控制、殺滅CMV，同時(shí)也是介導(dǎo)同種異體器官移植排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，引起急性排斥反應(yīng)［7］。關(guān)于CMV感染與急性排斥反應(yīng)，以往的觀點(diǎn)也認(rèn)為是機(jī)體與CMV相互作用，Th1應(yīng)答上調(diào)，細(xì)胞因子分泌增加或功能增強(qiáng)介導(dǎo)急性排斥反應(yīng)［8］，也有研究認(rèn)為 CMV IE1 和IE2基因產(chǎn)物協(xié)同作用反式激活了細(xì)胞間黏附分子（ICAM－1）基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而促進(jìn)ICAM－1 mRNA表達(dá)上調(diào)［9］。這種作用是CMV IE基因直接作用的結(jié)果，并不是宿主細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如TNF－α、IL－1、IL－6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）等介導(dǎo)的。

研究中發(fā)現(xiàn)，MCMV干預(yù)組的移植心肌的病毒滴度（蝕斑形成實(shí)驗(yàn)）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自體心肌中的病毒滴度（P＜0．05）。其具體機(jī)制尚不清楚。如前文所訴，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在清除CMV中起關(guān)鍵作用，但是，CTL（CD8＋淋巴細(xì)胞的一種表型）通過(guò)“HLA限制性”識(shí)別方式識(shí)別高表達(dá)HLA－Ⅰ類(lèi)抗原的受感染細(xì)胞而對(duì)CMV起到殺滅作用［9］，就是說(shuō)，CTL只能識(shí)別CMV感染的自身細(xì)胞，通過(guò)HLA－Ⅰ類(lèi)抗原的橋聯(lián)作用而殺滅CMV，對(duì)于HLA－Ⅰ類(lèi)抗原不同的移植心肌細(xì)胞而言，當(dāng)感染CMV時(shí)，CTL就顯得無(wú)能為力，這可能就是 MCMV干預(yù)組的移植心肌的病毒滴度（蝕斑形成實(shí)驗(yàn)）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自體心肌中的病毒滴度的原因。另外，機(jī)體還有一種免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞，NK細(xì)胞通“丟失自我（self－missing）”的識(shí)別方式，識(shí)別 HLA抗原表達(dá)低下或不表達(dá)的靶細(xì)胞以及HLA抗原突變的靶細(xì)胞，在抗病毒中起極其重要的作用［10］。研究表明，NK細(xì)胞不僅直接對(duì)CMV有殺傷作用，而且，還能增加CD8＋T細(xì)胞攻擊CMV的功能，由此可見(jiàn)，NK細(xì)胞可能是清除移植器官中CMV的關(guān)鍵［11］。

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