宋紅麗 李瀚旻 林立生 高 翔 趙賓賓 張 軍 吳 雨 晏雪生 肖 玲

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病研究所 (湖北武漢，430061) 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2010級(jí)研究生班

肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠模型是病證結(jié)合的肝再生動(dòng)物模型［1，2］前期研究結(jié)果表明，該模型能較好地揭示“腦髓生肝”、“骨髓生肝”和“精髓生肝”的科學(xué)內(nèi)涵，適用于研究高級(jí)神經(jīng)中樞、下丘腦-垂體-肝軸和神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控肝再生的作用及其機(jī)制［3，4］。本實(shí)驗(yàn)研究通過動(dòng)態(tài)對比觀察體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊對肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝再生的影響，探討“補(bǔ)腎生髓成肝”改善肝腎精虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 SPF級(jí)wistar新生大鼠 (由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供)，左旋谷氨酸單鈉 (Monosodium L-Glutamate，MSG)購自美國Sigma公司。體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則的地五養(yǎng)肝膠囊 (批號(hào):鄂藥制藥字Z20113160)由湖北省中醫(yī)院肝病研究所提供。

1.2 分組與處理方法 新生大鼠112只于出生后第2、4、6、8、10時(shí)皮下注射MSG造模，每次4mg/g體重 (即MSG大鼠)。另取新生大鼠53只在相同時(shí)間點(diǎn)皮下注射等體積生理鹽水;48只新生大鼠不做任何特殊處理。28天后離乳，分籠飼養(yǎng)，光照時(shí)間12小時(shí) (08∶00-20∶00)，溫度24℃左右，動(dòng)物自由飲水、攝食。6周時(shí)從造模存活的MSG大鼠中取80只隨機(jī)分為兩組，每組40只:肝腎精虛/MSG-肝再生大鼠模型組 (簡稱模型組)和治療組。從皮下注射生理鹽水的53只大鼠中隨機(jī)取40只作為鹽水對照組 (簡稱對照組)。又從不做任何特殊處理的48只大鼠中隨機(jī)取40只作為正常大鼠肝大部分切除再生組 (簡稱PHx組)。治療組大鼠按3g/kg劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊灌胃，其余兩組大鼠均以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃兩周后所有大鼠行肝大部分切除術(shù)。手術(shù)方法:無水乙醚吸入麻醉，腹部正中切口，暴露肝臟，按肝標(biāo)準(zhǔn)切除法［5］，在根部結(jié)扎并切除肝左葉和中葉 (約占全肝的68%)，分層縫合。MSG-大鼠按上述方法行肝大部切除后，即復(fù)制出肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠模型。PHx組和對照組大鼠按上述方法行肝大部切除后，即復(fù)制出經(jīng)典的肝再生大鼠模型。肝切除術(shù)均于上午08∶00～11∶00進(jìn)行，以避免晝夜節(jié)律對肝再生的影響，術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食、飲水，繼續(xù)給藥治療，方法同手術(shù)前。

1.3 標(biāo)本處理 每組動(dòng)物在術(shù)后1、3、7、10天時(shí)分別隨機(jī)取8只大鼠 (雌雄各半)，稱重后給予乙醚吸入麻醉。眼球取血后頸椎脫臼處死，快速取出肝臟并稱重，取出下丘腦和腦垂體。

1.4 計(jì)算肝再生度、肝再生指數(shù) 利用電子天平稱量肝臟濕重和動(dòng)物體重，根據(jù)下列公式［6］計(jì)算肝再生度和肝再生指數(shù)。肝再生度=［B－(A/0.684－A)］/A;肝再生指數(shù) (%)=B/C×100%，其中，A為切除的左中兩葉之肝重，B為再生肝重，C為動(dòng)物體重，0.684為切除的兩葉肝重與原肝重之比值。

1.5 計(jì)算再生肝肝細(xì)胞分裂指數(shù) 用手術(shù)刀切取小塊再生肝組織，10%甲醛溶液固定、石臘包埋，每只動(dòng)物隨機(jī)選取5張切片，蘇木素-伊紅染色后于油鏡下 (×1000倍)觀察，計(jì)數(shù)肝細(xì)胞核總數(shù)和肝細(xì)胞核分裂數(shù)，共計(jì)數(shù)肝細(xì)胞核1萬個(gè)以上，根據(jù)公式計(jì)算肝細(xì)胞分裂指數(shù) (MI):MI(%)=肝細(xì)胞核有絲分裂象 (個(gè))/肝細(xì)胞核總數(shù) (個(gè))×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝再生度、肝再生指數(shù)和MI比較見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝再生度、肝再生指數(shù)和MI變化比較 (±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝再生度、肝再生指數(shù)和MI變化比較 (±s)

與PHx組和對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 時(shí)段 肝再生度 肝再生指數(shù)(%)MI(%)0.22±0.08 1.46±0.13 0.86±0.16(n=32)術(shù)后3天 0.53±0.10 2.31±0.29 1.85±0.19術(shù)后7天 0.73±0.09 3.02±0.30 0.62±0.03術(shù)后10天 0.88±0.06 3.49±0.05 0.29±0.04對照組 術(shù)后1天 0.21±0.05 1.47±0.18 0.87±0.16(n=32)術(shù)后3天 0.54±0.09 2.33±0.42 1.81±0.04術(shù)后7天 0.71±0.11 3.07±0.13 0.67±0.18術(shù)后10天 0.90±0.10 3.46±0.05 0.28±0.05模型組 術(shù)后1天 0.34±0.10* 1.88±0.14* 1.05±0.12＊＊(n=32)術(shù)后3天 0.42±0.08* 2.07±0.04* 1.04±0.18*術(shù)后7天 0.57±0.12* 2.41±0.06* 0.41±0.16＊＊術(shù)后10天 0.70±0.08* 2.84±0.10* 0.15±0.03*治療組 術(shù)后1天 0.13±0.07 1.52±0.11# 0.77±0.14#(n=32)術(shù)后3天 0.50±0.05# 2.19±0.11# 1.89±0.13##術(shù)后7天 0.74±0.06# 2.84±0.12# 0.57±0.20##術(shù)后10天 0.86±0.03# 3.27±0.06# 0.28±0.04 PHx組 術(shù)后1天##

3 討論

中醫(yī)學(xué)有“肝腎同源于精血”的認(rèn)識(shí)。我們前期研究結(jié)果表明，肝腎精血證是慢性肝病病程進(jìn)展“髓失生肝”病因病機(jī)的基礎(chǔ)病證［7～13］。MSG-肝再生-大鼠模型是一種病 (肝臟病)-證 (肝腎精虛證)結(jié)合的動(dòng)物模型。 “補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則用于指導(dǎo)“髓失生肝”和“肝腎精虛證”的防治。肝腎精虛證的本質(zhì)是肝損傷與肝再生失衡，采用“補(bǔ)腎生髓成肝”減少肝損傷與調(diào)控肝再生是其根本大法［14，15］。地五養(yǎng)肝膠囊體現(xiàn)“補(bǔ)腎生髓成肝”治療法則。該方中熟地能甘溫補(bǔ)腎而養(yǎng)陰，五味子能增強(qiáng)補(bǔ)腎的功能，兩藥配合以補(bǔ)腎為主;茵陳清熱利濕退黃為主藥，姜黃辛溫通絡(luò)、活血化瘀為輔藥，生甘草清熱解毒，合為三瀉。五味子配甘草清熱養(yǎng)陰、酸甘化陰，合為佐使藥，全方共奏補(bǔ)腎而養(yǎng)肝、利濕而退黃、活血而通絡(luò)之功效。體現(xiàn)了“開源截流”、“補(bǔ)瀉兼施”的配伍規(guī)律，通過減少肝組織損傷和促進(jìn)肝再生修復(fù)的雙重作用以治療慢性肝病肝腎精虛證，實(shí)現(xiàn)肝臟組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝再生過程紊亂，表現(xiàn)為早期 (術(shù)后第1天)肝再生過亢，而中晚期肝再生抑制，經(jīng)地五養(yǎng)肝膠囊治療后，在肝腎精虛證改善的同時(shí)，其肝再生紊亂過程得到一定程度的糾正。提示地五養(yǎng)肝膠囊可能通過下丘腦-垂體-肝軸影響肝腎精虛/MSG-肝再生-大鼠肝臟再生修復(fù)，其作用機(jī)制尚有進(jìn)一步研究的空間。

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